Подтверждает ли амниоцентез мозаицизм плаценты: Инвазивная пренатальная диагностика и неинвазивные пренатальные тесты

© «IGR» Копирование материалов сайта запрещено. Лицензия МОЗ Украины АЕ № 197377

Преимплантационное тестирование – схватка над чашкой Петри

Добрый день, дорогие друзья! Я рад вас слышать. Точнее я рад вас видеть, и рад, что вы меня видите и слышите в нашем эфире. Сегодняшняя тема у нас была запланирована как продолжение прошлой о невынашивании беременности, но в этот план немножко вмешались события, которые происходят сейчас в Денвере. Вы знаете, что сейчас проходит большая конференция американского общества репродукции человека. И на прошлой неделе, точнее даже не на прошлой неделе, а в ночь с субботы на воскресенье была онлайн-конференция, посвящённая преимплантационной генетической диагностике, точнее преимплантационному генетическому тестированию, как это сейчас предлагается называть. И я посчитал, что мы должны по горячим следам на эту тему поговорить.

Преимплантационная диагностика

Итак, преимплантационная диагностика, схватка над чашкой Петри — the fight over the Petri dish. Это не мое выражение, а Джудит Дар, специалиста по биоэтике, которая давно работает в комитете по биоэтике при Американской ассоциации по репродукции человека. Она так назвала те события, которые происходят сейчас.

Мне хотелось бы немного рассказать об истории вопроса, прежде чем мы перейдём к разбору тех дискуссий, которые проходили в Денвере в 5 часов 15 минут по горному времени и в 2 часа 15 минут по московскому времени. Но я абсолютно не жалею о том времени, о той бессонной ночи, когда я смотрел в прямом эфире эту интереснейшую дискуссию. Итак, преимплантационная диагностика. Что это такое?

Механизм редукционного деления

Основной механизм: когда хромосомные сбои возникают у эмбриона в момент оплодотворения, это проблемы, связанные со сбоем, с неправильным течением мейоза. Это так называемое редукционное деление, которое лежит в основе созревания половых клеток – яйцеклеток и сперматозоидов. Вначале проходит первое деление, и хромосомный набор удваивается, потом проходит два последовательных деления, в результате которых получается яйцеклетка с 23 хромосомами и два полярных тельца, которые не участвуют в процессе репродукции. А при созревании сперматозоидов, материнская клетка даёт начало четырём сперматозоидам, в каждом из сперматозоидов имеется 23 хромосомы.

Сбои в процессе деления и его последствия

Процесс мейоза очень важен в процессе созревания половых клеток, потому что он позволяет поддерживать у потомства одинаковый по количеству и по составу набор хромосом. То есть 23 хромосомы сперматозоида встречаются с 23 хромосомами яйцеклетки и образуется новый организм, зигота, который имеет уже нормальный 46-хромосомный набор. Так бывает, если всё происходит правильно. Но в очень большом проценте случаев происходят ошибки – имеется очень высокий процент брака в процессе деления, мейоза. И в результате этого получаются сбойные сперматозоиды, сбойные яйцеклетки. Если такой сперматозоид или такая яйцеклетка участвует в процессе оплодотворения, то уже на момент зачатия возникают патологические по хромосомному набору эмбрионы, которые могут до какого-то этапа развиваться, а потом останавливаются в развитии. И если мы посмотрим на хромосомный состав эмбрионов, останавливающихся в развитии в первом триместре беременности, то около 60% из них будут иметь хромосомные сбои, которые были заложены на момент зачатия. Это так называемые мейотические сбои.

Кариотипирование плода

И тогда, поскольку это всё было известно достаточно давно, и все последующие исследования, которые проводились после Буэ и другими исследователями и в последующие годы, только подтвердили, уточнили концепцию о том, что сбои возникают именно на этапе мейоза. В очень большом проценте случаев вполне логично предположить, что если мы возьмём одну клеточку у эмбриона или несколько клеточек у эмбриона, если он уже немножко продвинулся в развитии, и если мы определим у эмбриона хромосомный набор, то уже совершенно чётко можем предполагать, какие эмбрионы хорошие, без хромосомных сбоев, а какие эмбрионы плохие.

Эти методики возникли и по сути своей развиваться начали параллельно с самой методикой ЭКО. Мы с вами знаем про нашего соотечественника, Юрия Верлинского, биолога, который в годы, предшествующие перестройке, эмигрировал в США и он начал этим заниматься – определением кариотипа развивающегося плода, ещё до того как появилась методика ЭКО. И в Чикаго он создал свой центр и предложил целый ряд методик, которые потом вошли в состав методики ЭКО, а именно различные варианты преимплантационной диагностики и на первом этапе всё было очень логично.

Как происходит определение кариотипа эмбриона?

Мы берём у эмбриона одну клетку, определяем хромосомный набор, получаем информацию о хромосомном наборе эмбриона и дальше можем разобрать хорошие и плохие эмбрионы. И дальше вы помните, как это всё было в начале 2000-х годов, в конце 90-х годов, когда методика преимплантационной диагностики только появилась, сколько надежд было связано с этой методикой. Они были ещё не такие совершенные, как сейчас и в основном проводились на трёхдневных эмбрионах. То есть на стадии, от 6 до 8 клеток у них брали одну клетку, определяли хромосомный набор и отбраковывали. А дальше хорошие эмбрионы подсаживались, первые результаты были очень обнадеживающие.

Когда методика только начала развиваться, это смотрели на малых группах, и у молодых женщин, там, где был большой выбор эмбрионов. Но когда экстраполировали на всю популяцию, оказалось, что в общем никакого увеличения процента живорождений при такой методике, когда мы смотрим хромосомный набор у трехдневного эмбриона, нет. Более того, выживаемость таких эмбрионов, у которых брали 1 клетку на стадии 6-8 клеток, была очень пониженная. Исследователи, которые смотрели большие ряды результатов, в результате такой преимплантационной диагностики пришли к выводу, что такого типа преимплантационная диагностика слишком травмирующая для эмбриона и нужно смотреть наружную, так называемую трофоэктодерму у эмбриона на более поздней стадии – пятидневной, где количество клеток составляет 20-250 клеток, и можно взять сразу несколько клеток путём пункции.

Развитие кариотипирования и преимплантационной диагностики

И постепенно с начала 2000-х годов начала развиваться методика именно определения кариотипа путём пункции трофэктодермы и определения кариотипа наружной трофэктодермы эмбриона. Мы с вами помним, что ещё где-то десять лет назад эта методика редко использовалась, потому что те методики определения кариотипа точнее диагностики анеуплоидии были недостаточно совершенными, занимали большое время, чтобы успеть подсадить этот зародыш на стадии пяти дней. Поэтому на первом этапе, когда начали производить диагностику преимплантационную первых эмбрионов, то часто эти эмбрионы криорезервировались и потом уже после разморозки шли на подсадку в следующие циклы. Потому что физически врачи-лаборанты и генетики не успевали дать результат врачам-клиницистам, которые позволили бы выбрать, какие эмбрионы хорошие, с хорошим кариотипом, какие плохие.

И вот, начиная где-то с конца нулевых и все эти десятые годы мы видели, как последовательно шло развитие преимплантационной диагностики. Метод преимплантационной диагностики всё более и более усложнялся, возникла целая индустрия, которая включает в себя не только специалистов, которые умеют делать всё, но и сложное оборудование. Цитогенетические методы были вначале заменены методами Фиш: гибридизацией энсибом. Методика Фиш была заменена микроматочным анализом, но и микроматочный анализ перестал удовлетворять специалистов.

Приход к NGS и ее механизм

Спустя какое-то время, в 16-м году международная организация PGDIS – это международная организация, которая объединяет специалистов по преимплантационной диагностике, опубликовала заявление о том, что они ответственно заявляют, что происходит переход на новую систему NGS, которая заменила собой все пять платформ, использовавшихся на Западе для преимплантационной диагностики. Этот скрининг нового поколения представляет из себя секвенирование всей ДНК, получаемой при пункции эмбриона на пятые сутки, при этом технология позволяет давать заключение по наличию или отсутствию анеуплоидии достаточно быстро. Таким образом, врачи имеют возможность при получении неправильного, аномального или положительного результата принять решение сразу, в этом же цикле.

Методика, которая предложена, и является сейчас той, которая продвигается во всём мире, но прежде всего на Западе, в США и в странах Европы предполагает пункцию пятидневного эмбриона, т.е. пункцию наружной трофэктодермы. И в результате этой пункции получается примерно 5 клеток, от 5 до 6 ядер, которые идут дальше в исследование. Таким образом, мы получаем 3 вида результатов. Один результат, когда анализ абсолютно нормальный и хромосомные аномалии не обнаружены и более, чем в 80% клеток нормальный кариотип. Второй анализ, это когда меньше чем в 20% клеток нормальный кариотип, то есть по крайней мере 4 из 5 ядер имеют хромосомные аномалии. И дальше появляются промежуточные результаты, когда процент клеток с хромосомными аномалиями составляет от 20 до 80%. Есть такая градация, которая была определена самой этой реализацией и специалистами, которые эту реализацию представляют. И эта методика получается с июля 16 года активно продвигается на Западе и активно используется во всем мире, в том числе в США.

Проблема освоения: мозаики наружной трофэктодермы

И с чем столкнулись специалисты, когда начали работать внутри этой парадигмы? Они столкнулись с проблемой мозаик наружной трофэктодермы, когда разные клетки могут иметь разный кариотип. Что может быть часть клеток с нормальным кариотипом, так называемые эуплоидные клетки, а другие будут иметь аномальный кариотип, так называемые анеуплоидные клетки. И случилась эта загвоздка, которая привела к настоящей битве титанов. Битве, как очень точно выразилась специалист по биоэтике, профессор, кто недавно написала статью с таким названием, которая вышла в августе 2018 года, над чашкой Петри. Оказалось, что по своей природе трофэктодерма является тканью с очень нестабильным процессом деления клеток. То есть мозаики являются характерной особенностью делящихся клеток трофэктодермы. И это так называемые мейотические аберрации.

Мы с вами говорили сегодня, когда начали обсуждать эту тему, что существуют мейотические аберрации, которые 100% дают начало аномальному эмбриону, которые с вероятностью более 99,5% остановятся в развитии в первом триместре. А во многих случаях даже не дойдёт до процесса имплантации. То есть даже мейотические аномалии хромосомные это те аномалии, которые закладываются либо в момент зачатия либо на самых-самых первых этапах деления зиготы. А когда мы имеем дело с подавляющим большинством случаев, так называемых мозаик трофэктодермы, это не мейотические аномалии, а митотические аномалии. Это аномалии, которые возникают в момент деления клеток трофэктодермы. Клетки делятся, они делятся быстро и должны делать экспансию, внедряться в материнский организм, дальше идти и заселять. Колонии этих клеток заселяют стенки спиральных артерий, которые питают матку.

Процесс абсолютно аналогичный процессу сперматогенеза, когда на качество можно не обращать внимания, важно как можно быстрее успеть продвинуться в этой экспансии для того, чтобы взять в дальнейшем под свой контроль материнский организм. Оказалось, что эти мозаики являются очень важной особенностью, биологической особенностью трофэктодермы, о которой ещё недавно мало что знали. Предполагали, что такое может быть, и иногда в литературе вы встретите заявления, что это бывает в 3% случаев, 5% случаев, в 1% случаев. На самом деле если внимательно смотреть весь геном трофэктодермы, то в 90% вы будете находить то или иное число клеток с мозаиками. Исходя из этого, промежуточные результаты преимплантационного тестирования являются показанием к тому, чтобы с позиции сторонников преимплантационного тестирования эти зародыши использовать дальше для подсадки.

Почему убрали слово преимплантационная диагностика относительно хромосомных аномалий?

Если мы признаем большой процент мозаик, которые могут быть внутри такого анализа, то получается, что сама диагностика неточная. То есть мы имеем дело или с преимплантационным скринингом на аномалии, который может иметь определённый процент ошибки, и ложноположительных и ложноотрицательных результатов. И также могут быть и ложноположительные и ложноотрицательные результаты в зависимости от того, в какую точку трофэктодермы попадёт пункционная игла, с помощью которой добываются эти клетки. То есть точной диагностики методика дать не может. Поэтому и ушли от слова «преимплантационная диагностика», которое до сих пор ходит внутри сообщества наших специалистов, но по-тихоньку заменяется «преимплантационным скринингом», «преимплантационным тестированием» с добавлением буквы «А» — на анеуплоидию. И врачи, то есть мы с вами, которые ведут пациентов, и которые занимаются методикой ЭКО, должны об этом знать.

Если мы получаем результат преимплантационного тестирования пятидневного эмбриона с помощью определения кариотипа трофэктодермы наружной, то мы должны понимать: определённый процент ошибок существует. И те врачи, акушеры-гинекологи, которые ведут беременность, и врачи тех клиник ЭКО, внутри которых достаточно широко применяются методы преимплантационного тестирования, сталкивались с такими ситуациями и должны об этом знать. У меня такие случаи возникают раз в несколько месяцев.

В чём сложность определения результата скрининга

Когда ко мне приходят пациентки после ЭКО и говорят: вот я пришла, сдала НИПТ. В 11-12 недель она сдаёт анализ на определение свободных витальных ДНК и определение хромосомных аберраций с помощью такого скринингового метода, который определяет 4-5 хромосом. Х, У и три основных трисомии. И вдруг оказывается, что пациентке делали преимплантационную диагностику, преимплантационное тестирование, подсадили по виду нормальный зародыш. Ей говорили, что больше ничего делать не нужно, её уверяли, что скрининга первого триместра, скрининга второго триместра, тем более какого-нибудь преимплантационного тестирования ей не нужно проводить, потому что они уверены, что хромосомный набор был нормальный.

И вот пациентки приходят все в слезах, говорят: вот я пошла, сдала и у меня идёт хромосомная аномалия. Она идёт в другое место, сдаёт и там тоже подтверждается. И дальше: я подам на них в суд, как они могли! Я успокаиваю пациентку всегда в таких случаях, потому что очень важно, чтобы пациентка понимала: здесь врач абсолютно не при чем. То есть врач и пациент в такой ситуации сталкиваются с обычной биологической проблемой. Ложноположительным или ложноотрицательным результатом, который лежит в самой основе скрининга, в самой основе методики. То есть на сегодняшний момент мы столкнулись с биологической проблемой, в том виде, в каком она используется и не даёт нам точной диагностики. И нам говорят, что вот эта методика будет заменена на другую, но пока можно её использовать.

Острый вопрос в сохранении верного зародыша

Тогда встаёт вопрос – как нам быть с пациентками более старшего возраста, которые составляют львиную долю пациенток, обращающихся в клиники ЭКО? И если мы не уверены в том, что тот кариотип, который мы получаем при преимплантационной диагностике, является правильным, значит мы можем потерять хороший зародыш, который внешне может казаться по результатам тестирования аномальным, но он даст хорошее развитие в полости матки. Эта проблема она очень серьёзная. Первое – мы имеем определённый процент ошибок, о которых врач должен понимать. Причём, ошибок не врача, не лаборатории, не самой диагностики, а ошибок из-за биологии самого эмбриона, того как развивается плацента. Развивается инвазия трофобласта. Это быстро растущая, быстро делящаяся агрессивная ткань.

И второй момент, о котором очень часто забывают врачи. А ведь получается, что у нас нет преемственности между врачом, который делал ЭКО, и врачом, который наблюдает беременность. Эти пациентки потом могут приходить в женские консультации и говорить – вот я там делала и у меня всё хорошо. Ей подсадили хороший, нормальный, правильный зародыш, но пациентке не делают тех тестов, которые должны были делать. Это пренатальный скрининг первого триместра и возможно второго триместра на хромосомные аномалии. А делать их нужно обязательно, потому что возможны коллизии, связанные с этой проблемой.

Нужна ли преимплантационная диагностика?

И вот возвращаемся к Денверу. Профессор Гляйхер в прошлом году, вернее в этом году, а это очень известный американский генетик, который заведовал кафедрой акушерства и гинекологии и занимался и иммунологией репродукции и очень глубокой генетикой, он выступил со статьей, в которой утверждает: методика несовершенна. В результате этой методики много эмбрионов потенциально нормальных не подсаживается в полость матки, и те преимущества, которые даёт преимплантационная диагностика, когда отбирается хороший хромосомный набор, внутри этих эмбрионов процент плохих эмбрионов будет гораздо меньше. Подсадка такого эмбриона даёт больший успех при имплантации и больший процент вынашивания беременности.

Профессор говорит – если «плохой эмбрион» окажется хорошим, потому что мы не в ту точку случайно попали, и его не использовали, какой у него процент имплантации? Равняется нулю, потому что мы его не довели до имплантации. И поэтому идёт большое количество медицинских центров в Америке и всё больше врачей, занимающихся ЭКО, отказываются принципиально от методики преимплантационного тестирования, скрининга на хромосомные аномалии. С точки зрения этих врачей, мы получаем неприемлемо высокий процент ошибок, которые принимаем за тактики ведения.

Два мнения об одной проблеме диагностики

Посмотрите журнал, последний номер «Fertility and sterility», «За и против преимплантационного тестирования на генетическую анеуплоидию; клиническое и лабораторное исследование». Вы знаете, со времен Войны Роз в иммунологии 2000-х я ничего подобного не видел никогда. Чтобы американское общество репродуктологии опубликовало статью, в которой два мнения идут параллельно.

Профессор Ричард Скотт, достаточно известная личность, мы можем о ней поговорить, но не сегодня. И профессор Ричард Паульсен — две совершенно разных идеи. Профессор Скотт является одним из ведущих промоутеров идеи, что преимплантационное тестирование на анеуплоидии полезно и должно проводиться в широком масштабе, всем практически своим пациенткам. В 97% случаев в его клинике идёт подсадка одного эмбриона с достаточно высокой частотой наступления беременности и вынашивания беременности до срока. Это очень известный специалист по ЭКО.

Так вот профессор Ричард Паульсен, является принципиальным и очень активным противником этой методики. И дальше, если мы спускаемся на несколько страниц, мы видим: одна колонка, левая, это сторонники, правая это специалисты, в том числе профессор Норберт Гляйхер – два совершенно противоположных мнения. И это абсолютно беспрецедентный факт. Как вы понимаете, я отслеживаю медицинскую прессу очень активно, и такого никогда не видел – идёт самая настоящая схватка. И очень важно и очень интересно, что Соединенные штаты указали на то, что в принципе, они здесь открыто могут выходить на такую дискуссию, а не кулуарно. Ведь многие вещи решаются очень закрытыми кулуарными вещами, где-то за закрытыми дверями и потом все выходят с единым решением. Здесь этого единого решения мы не видим, они позволили выйти настоящей дискуссии с предъявлением двух несовместимых и абсолютно противоречащих друг другу мнений.

«За» и «против» преимплантационной диагностики

Вот эта вот статья из августовского номера «Fertility and sterility» с огромным списком литературы. И что ещё отрадней для нас, врачей, потому что мы с вами должны понимать, о чём идет речь – то, что в рамках Денверской конференции те из нас, кто не смогли туда поехать, потому что я думаю, что часть специалистов из России наверняка там присутствует, имели возможность принять участие в онлайн-конференции и видеть практически всех участников дискуссии по поводу за и против преимплантационной диагностики, которая прошла по московскому времени в ночь с субботы на воскресенье.

Посмотрите пожалуйста, здесь мы видим участников дискуссии, здесь мы видим зал, в котором проходила вот эта конференция. И мнения сторон были абсолютно друг другу несовместимы. Те люди, которые выступали за преимплантационную диагностику, говорили, что она очень важна, хороша и позволяет повышать процент. Те люди, которые выступали против, аргументировали свою точку зрения и говорили, что в том виде, в котором она сейчас существует, она не годится, для широкого применения такая дорогостоящая методика не пригодна. В начале конференции, как и в журнале «Fertility and sterility» мы видим: левая сторона занимается сторонниками процедуры преимплантационного скрининга, а правая противниками. И здесь мы видим профессора Скотта, профессора Пальмера, профессора Гляйхера, то есть всех тех участников, которые активно публиковали статьи в защиту или против этой вот методики.

И что здесь можно сказать? Каждый из участников получил по пять минут, и в течение пяти минут должен был высказать свою точку зрения. Вот посмотрите типичный совершенно приём, который используют противники преимплантационного тестирования, посмотрите на профессора Паульсона, который держит в руках футбольный мяч. Этот футбольный мяч имеет красные пятна, остальная часть белая. Он очень хорошо демонстрирует, что мы получаем, когда проходит преимплантационная диагностика. Мы внедряемся, случайным образом абсолютно, биопсийной иглой в зону наружной трофэктодермы. И по техническим условиям, когда происходит засасывание внутрь биопсийного материала, туда попадает 5 или 6 клеток трофэктодермы, которые идут дальше для исследований.

Если мы имеем ситуацию, которую я вам описал, когда процент этих зон с анеуплоидией достаточно большой, то включается элемент случайности. Или игла попадает в абсолютно нормальную зону или игла попадает в ненормальную зону. Если игла попала в ненормальную зону, то это вовсе не значит, что эмбрион плохой. А если игла попала в нормальную зону, это вовсе не говорит о том, что у эмбриона не может быть каких-то проблем.

Профессор Польсон отстаивает следующую точку зрения: для молодых женщин, у которых много эмбрионов, вы можете позволить себе много. Но что поделать, если пациентка не молода (а он работает с пациентками, которым за 40, много пациенток, которые наблюдаются у него в центре, это пациентки старшего репродуктивного возраста, когда само получение яйцеклеток достаточно проблемно), и если с эмбрионами идут какие-то сбои? Да, у них есть какой-то процент сбоев, которые могут дать основания для остановки беременности или неприживления или каким-то проблемам, но зато мы можем это всё испытать. А если зародыш не будет использоваться, что мы тогда получим? Мы получим нулевой эффект. Как я и говорил, этот зародыш, который хороший, мы просто считаем его плохим, не будет иметь никаких шансов. Поэтому они говорят «дайте матке шанс!». Дайте организму, самой матке возможность распознать, какой эмбрион хороший, какой плохой.

Важный вопрос безопасности эмбриона

Второй вопрос касается безопасности самой процедуры для эмбриона. Потому что сторонники процедуры преимплантационного скрининга на анеуплоидии, говорят, что сейчас проводятся перспективные исследования, которые показывают, что всё очень-очень хорошо. Но правая сторона, она говорит: ребята, мы с вами знаем, проводились исследования, что количество открытий двери шкафа термостатного, в котором происходит развитие эмбриона, влияет на развитие будущего ребенка, как вы думаете, ему безразлично, что вы возьмете из этих двухсот клеток 5-6 и сделаете пункцию этого эмбриона? Что с ним будет происходить? И тоже не получаем никакого ответа. Якобы все эти перспективные исследования не показывают никаких проблем.

В дискуссии вышла доктор, которая говорит: я делаю эти процедуры, я сама делаю эти биопсии, но я не уверена в том, что на здоровье детей, которые родятся, это никак не отражается. Потому что мы знаем, сколько сейчас проводится исследований, которые изучают влияние различных манипуляций с эмбрионами на здоровье уже будущего человека, который родится. Поэтому вопрос очень острый. Если мы имеем методику, которая не даёт нам 100% результата, то нужно ли применять её в таком масштабе? Практически рекомендуют делать это чуть ли ни 100% женщин. Причём, основные исследования проводятся на достаточно молодой группе женщин, тех, которые дают достаточно большой выход эмбрионов и процент женщин более старшего возраста там меньше, потому что меньше выход этих эмбрионов.

Поэтому они говорят, что не совсем точно идёт формирование этих групп, и что эти исследования сдвинуты в сторону того, что мы экстраполируем данные молодых женщин на всех женщин в целом, которые участвуют в процессе ЭКО. И дальше получается, мы видим выступали другие участники дискуссии, по одному рассказывали, что хорошо, что плохо. В процессе самого исследования был онлайн-опрос, в котором принимали участие все те, которые, как и я, участвовали онлайн. Можно было задавать вопросы, и нас спрашивали, что каждый думает по этому поводу.

Влияние мозаик требует доказательств

И очень интересно было выступление профессора Гляйхера: он сказал, если вы предложили такую методику, то по идее вы должны были провести все исследования. Как влияет процесс на мозаики, какой процент мозаик, что делать с этими мозаиками. Он сравнивает с теми фармацевтическими компаниями, которые проводят исследования различных препаратов, прежде чем выводят их на рынок. Ещё до того, как препараты выводятся на рынок, проводятся все исследования на животных, потом проводятся преклинические и клинические исследования. После этого принимается, хороший препарат или плохой. Очень многие препараты, на которые тратятся огромные суммы денег, так и не доходят до рынка, потому что в процессе исследования что-то меняется.

Основная мысль профессора Гляйхера заключалась в том, что ребята, если вы нам хотите доказать, что эта методика хороша во всех отношениях – доказывайте. Почему мы должны проводить какие-то исследования, смотреть, годится эта методика или нет. Методика ещё достаточно сырая с точки зрения биологии, и мы должны использовать её с осторожностью. Основная проблема в том, что мы получаем информацию о так называемых митотических хромосомных аберрациях, митотических анеуплоидиях, которые не имеют никакого отношения к тому, какой набор хромосом внутри клеточной массы. А для того, чтобы получить набор информации о внутренней клеточной массе, мы должны получить хотя бы хромосомы яйцеклетки. Если мы будем получать хромосомы яйцеклетки, то мы тогда будем получать информацию о том, что со стороны яйцеклетки нет никаких проблем. И тогда вопрос пациенток старшего возраста решается достаточно просто – мы выбираем для исследования только те яйцеклетки, которые имеют нормальный хромосомный набор. Причём, профессор Гляйхер говорит, что для этого можно использовать кариотип полярного тельца. И вот здесь мы получаем выход на очень интересную тему.

Вывернутый наизнанку кариотип яйцеклетки и снижение вероятности анеуплоидий

Сам профессор Гляйхер говорит: вот у нас был этот русский так называемый Верлинский Юрий, который туда эмигрировал и начал заниматься преимплантационной диагностикой и предложил определять кариотип полярного тельца. То есть можно определять кариотип первого полярного тельца, и тогда яйцеклетка будет иметь все то, чего нет в этом первом полярном тельце. То есть первое полярное тельце получит в результате разделения кариотипа вторую половинку хромосомного набора материнского организма, которая дальше не попадёт в яйцеклетку. Это вывернутый наизнанку кариотип яйцеклетки. Либо же мы смотрим кариотип второго полярного тельца, который полностью соответствует кариотипу яйцеклетки. Если пойти по этому пути, мы уходим от проблемы мозаик, уходим от проблемы митотических анеуплоидий, спускаемся чисто на проблему мейотических анеуплоидий. То есть мы сразу можем отсечь те яйцеклетки, которые будут хромосомно неполноценны.

Причём, определение кариотипа полярного тельца предложил еще в 90-е годы Верлинский. Он говорил: почему в Европе определяют кариотип полярного тельца, и я думаю, что те наши слушатели, которые слушали несколько лет назад доклад профессора Файфингера из Вены, помните, насколько это было интересно, и насколько он интересно рассказывал, как они в Вене не используя преимлантационную диагностику эмбрионов, определяют кариотип полярного тельца и насколько это позволяет улучшить методику. Мы не знаем, какой сперматозоид оплодотворит яйцеклетку, и не знаем кариотип сперматозоида, но можем очень чётко определить кариотип полярного тельца и можем резко снизить вероятность анеуплоидии.

Основной источник анеуплоидии все-таки яйцеклетка, а не сперматозоид. И вот здесь интересно, что Нобелевская премия по химии в этом году присуждена исследователю, который придумал так называемую лазерную ловушку. Эта ловушка позволяет очень нетравматично получать полярное тельце при получении яйцеклетки и таким образом совершенно чётко понимать, какой набор идёт у яйцеклетки. Интересное пересечение – профессор вряд ли думал об этой Нобелевской премии, когда выступал, но тем не менее он затронул очень важный и перспективный вопрос.

Новая перспектива для процесса оплодотворения

Если мы сейчас начнём заниматься методикой определения полярного тельца, то мы можем получить совершенно другую перспективу. То есть другое видение того, какие яйцеклетки лучше использовать для процесса оплодотворения. Интересно также то, что я разговаривал с эмбриологами и всё время задавал вопрос: вы не делаете кариотип полярного тельца? И мне всё время отвечают: нет, мы этим не занимаемся.

Я не знаю, занимаются ли у нас определением кариотипа полярного тельца, и вообще, какие методики используются у нас для преимплантационного скрининга на анеуплоидию. Потому что если смотришь те результаты, с которыми приходят пациентки, большинство тех результатов, которые используются это метод fish, что на западе практически заменено новым поколением. Редко видишь микроматричный анализ, в основном методики fish. Здесь конечно отдельная тема – экстраполяция того опыта, который сейчас есть на Западе.

В процессе дискуссии было сказано «Я вам сейчас кое-что покажу» и появился такой же футбольный мяч, но говорилось здесь уже о другом. Почему процент мозаик, который получается в результате нынешнего вида преимплантационного скрининга, такой маленький? Потому что он показывает – для того, чтобы получить мозаику, нужно чтобы игла попала вот в эту зону. Между белым и красным. Там, где эти зоны сходятся друг с другом. Тогда вы получите и нормальные и ненормальные клетки. Но вероятность этого очень маленькая. Поэтому процент мозаик, который получается в результате этого преимплантационного скрининга получается гораздо меньше, чем мог бы быть в реальности.

Поэтому интересная дискуссия прошла в эти выходные и дальше была достаточно интересная дискуссия внутри зала. Вот этот доктор задавала вопросы по поводу здоровья будущего ребёнка, и как может преимплантационная диагностика отразиться на здоровье будущего ребёнка. Дальше вышел пожилой доктор из Египта и задал вопрос: вы говорите, что это всё удешевляет, саму процедуру ЭКО, но мы знаем насколько это удорожает процедуру ЭКО.

Сторонники преимплантационной диагностики говорят, что это удешевляет процедуру ЭКО, потому что мы уменьшаем количество подсадок, добиваемся сокращения сроков наступления беременности. А на какой срок уменьшается срок необходимый для наступления беременности? Ответ – на 11 дней такой период. Это несерьезно, ребята. На такой ноте закончилась интереснейшая дискуссия, которая проходила в рамках форума, который сейчас проходил в Денвере.

Итоги и выводы участников конференции

И также я хотел сказать, что были объявлены результаты голосования. Они показали следующее: в самом начале конференции примерно 75% участников и виртуальных участников используют PGD в своей практике и 25% не используют. В результате конференции большая часть участников сказала, что они не поменяют своих подходов. Кто использовал, те будут продолжать использовать, кто не использовал – те не будут использовать. Но интересно дальше был вопрос – какой процент участников будет использовать преимплантационную диагностику чаще, чем она используется сейчас? И оказалось, что таких было 12 процентов.

Следующий вопрос – какой процент участников конференции будет использовать преимплантационную диагностику реже чем сейчас? Таких оказалось 16%. Мы видим чёткий совершенно тренд в сторону того, что всё большее количество специалистов по IVF будет снижать использование преимплантационного скрининга на ануеплоидию, особенно у пациенток старшего возраста, там где каждый эмбриончик на вес золота. Что лучше такой эмбрион подсадить в полость матки и дать ему возможность развиваться, чем утилизировать. У нас есть целый ряд методик, которые позволяют в дальнейшем, если идёт развитие после 8 недель беременности, чётко провести и скрининговые исследования и диагностические исследования на предмет наличия или отсутствия анеуплоидии.

Вот такая любопытная была пресс-конференция. Никакой точки здесь не поставлено, но я так полагаю, что такая осторожная организация как Американское общество репродукции человека, если она вынесла это все на дискуссию, значит внутреннее недовольство результатами самой методики нарастает, и, возможно, это приведёт к тому, что мы получим более совершенную неинвазивную методику преимплантационного исследования эмбриона возможно с использованием свободной фетальной ДНК, которая позволит дать более точную информацию по крайней мере в отношении мозаик и не мозаик.

Мозаицизм в женском организме и его влияние на ребёнка

Исследования профессора Муннэ на мышах показали, что в общем-то процесс мозаицизма он достаточно интересен. Сама по себе наружная трофэктодерма обладает очень высокой склонностью к мозаицизму. Но женский организм каким-то образом отслеживает сигналы мозаицизма, и если процент мозаицизма у трофобласта превышает определённый размер, то тогда беременность останавливается в развитии. Организм не даёт ей развиваться. Если мозаицизм трофобласта находится в рамках, условно говоря, нижней границы, то мы будем получать нормальное развитие эмбриона.

В связи с этим я ещё раз хотел бы сказать то, что говорил на прошлой нашей встрече, наружный кариотип плаценты и мозаицизм плаценты может быть настолько высок, что он может абсолютно не соответствовать кариотипу плода. И вот на последней конференции по перинатальной медицине, которая проходила в Петербурге в начале сентября, был доклад клинического случая, документально подтвержденного, когда с помощью ПИД была получена трисомия по второй паре, редчайшая трисомия, а при этом они сделали кариотипирование плода путём амниоцентеза и был получен нормальный кариотип. И беременность развивалась до 34 недель и родилась здоровая недоношенная девочка без каких-либо проблем со здоровьем. И кариотип ребёнка оказался абсолютно нормальным женским кариотипом, а кариотип плаценты оказался 90% по-моему 47+2, т.е. 46ХХ + вторая хромосома. То есть трисомия была по второй паре – редчайшая трисомия, редчайшая аномалия.

Поэтому я ещё раз хочу обратить ваше внимание, что когда мы определяем кариотип трофобласта или плаценты, он не всегда совпадает с кариотипом эмбриона. Поэтому очень важен амниоцентез. Он никуда не уходит, амниоцентез и кордоцентез остаётся. Даже если неинвазивный пренатальный тест даёт вам неправильный результат, западники все-таки ждут дальше и делают амниоцентез, и если он показывает аномальный кариотип плода, тогда уже предпринимаются действия какие-то. Здесь уже вопрос и этически и медицинский сложный.

Возможно ли возродить неандертальцев и методика CRISPR CAS 9

Вот, собственно, что мне хотелось рассказать по поводу такого интересного направления. И в связи с предыдущей нашей беседой, когда я говорил о кариотипировании неандертальцев, возникали разные вопросы, почему мы этот вопрос затрагиваем вообще. Вопрос достаточно интересный.

Потому что во-первых, мы, по крайней мере люди европейского происхождения, являемся носителями 2% генов неандертальцев. А жители, которые имеют азиатские корни, они имеют в достаточно большом проценте случаев, континентальная Азия в 75% случаев, являются носителями генов, так называемых денисовцев. Непонятно, как они выглядели, но их геном нам известен лучше, чем геном многих людей. То есть настолько хорошо помогли исследования нескольких костных остатков, обнаруженных на Алтае, определить то, что это были родственники человека.

Есть такой профессор Джордж Черч. Это профессор Гарвардского университета, который занимается проблемами синтетической биологии. И вы видите вот здесь скелет мамонта, ДНК мамонта и дальше вы уже видите мамонта во плоти. В настоящее время вопрос о том, что возможно возрождение умерших видов, он достаточно широко обсуждается и по крайней мере в лаборатории профессора Дэвида Рейха на поток поставлено определение кариотипов костных останков неандертальцев и других видов вымерших. И эти геномы расшифрованы достаточно хорошо. Одновременно то, что пишет профессор Джордж Черч, и вы в интернете можете послушать его лекции, он достаточно интересный лектор, он говорит о том, что методика CRISPR, редактирование генов, так хорошо в настоящее время развита, что можно отредактировать всё.

Берётся стволовая клетка человека, и дальше внутри этой стволовой клетки происходит редактирование генов. Гены, характерные для современного человека, заменяются, редактируются, заменяются генами, которые были у неандертальцев, а это не такой сложный процесс, потому что у нас с неандертальцами 99,5% генов общих. Разница идёт только по половине процента генов. И после этого клетка идёт по пути развития эмбриона, подсаживается в матку женщины и женщина рождает уже неандертальца.

В интервью журналу «Шпигель» несколько лет назад Джордж Черч сказал, ему задали вопрос – может ли вот так родиться неандерталец? Он говорит: технически никаких проблем нет. Если женщины захотят, мы не против, только не хватает тех женщин, которые бы согласились. И вы представляете, после того, как это интервью было опубликовано в журнале «Шпигель», в журнал посыпались предложения со стороны женщин. Это были сотни предложений, сотни писем – женщины предлагали себя в качестве суррогатной мамы для того, чтобы возродить неандертальцев.

И вот в этой книжке «Ориджинезис», я рекомендовал бы вам её прочесть, написано, как синтетическая биология обновит природу и нас самих. Может быть появятся мамонты, если мы отредактируем стволовую клетку слона, можно подсадить слонихе и родится мамонт. Шерстистые носороги, саблезубые тигры, саблезубые коты, все эти млекопитающие, которые вымерли в последние несколько десятков тысяч лет, от которых остались ДНК, их можно возрождать. Поэтому вопрос этот встаёт достаточно интересный. И много публикуется по этому поводу, о проблеме неандертальцев очень интересной. И вообще проблема эволюции человека, проблема, которая должна быть в принципе интересна для врачей, которые занимаются проблемами репродукции.

Я бы здесь конечно рекомендовал – некоторые здесь читали, но большинство конечно не читали – книгу Уэллса «Машина Времени», где описывается путешествие во времени и деградация человека, если оно пойдёт по пути удовлетворения всех бесконечно возникающих потребностей. Описывается общество, которое пошло по пути марксизма. Капиталисты, условно говоря, или аристократия и пролетариат дали направление двум разным ветвям человечества, которое стало пожирать друг друга и деградировало морально. Поэтому он говорит – наш 19 век! А в том рассказе, который послужил прообразом и первоосновой «Машины времени», «Кроник Эргонотс» — аргонавты по времени или аргонавты времени, она есть в переводе на современный русский язык, там очень чётко описывается священник, которого этот аргонавт на машине времени прокатил по времени. И он попадает в итоге на небольшой островок в болоте, выходит оттуда и говорит: какой век сейчас? 19й. Слава богу! То есть тот век, в котором жил Уэллс, при том, что у него были достаточно пессимистичные взгляды на будущее человечества, это мы видим по главе «Серые человечки», которая не вошла в основной текст, но достаточна интересна. Поэтому я бы советовал эту книгу прочитать. И может быть формат наших встреч не позволяет, но Уэллс является одним из моих любимых писателей. И возможно все-таки как-нибудь мы поговорим отдельно на такую отвлечённую литературную тему.

Я надеюсь, что сегодняшняя встреча была вам интересна. В следующий раз мы будем говорить о невынашивании беременности, продолжим наш разговор, будем говорить о HLA-совместимости и HLA-несовместимости в генах HLAи их связи с процессом репродукции. А через одну беседу это будут ответы на вопросы, поэтому если есть какие-то вопросы, пожалуйста задавайте. Я очень рад всем тем, кто дослушал нашу беседу до конца, я желаю вам всего самого хорошего и прощаюсь с вами! Удачи вам, господа.

Неинвазивный пренатальный тест — VMC Verte medical clinic

Отличия NIFTY от обычного скрининга

Современная неинвазивная пренатальная генетическая диагностика NIFTY является новейшим достижением медицины. Она превосходит ранее применяющиеся методы выявления хромосомных нарушений по всем показателям, включая точность и скорость. Тест NIFTY является лучшей альтернативой традиционно использующимся диагностикам.

Использующиеся ранее скрининговые методики:

Наиболее распространенная в России методика оценки риска — совокупный учет массы признаков, среди которых наиболее важную часть составляют данные УЗИ и биохимических исследований крови. Биохимические маркеры — это гормональные исследования крови беременных. УЗИ отслеживает толщину воротниковой зоны. Показатели такой диагностики: 5% ложноположительных при чувствительности 60−80%.

Хорионбиопсия — взятие для анализа фрагмента хориона — ткани плода на ранних сроках беременности. Выполняется на сроке 9−12 недель. Характеризуется высокой точностью: >99% чувствительность. Является инвазивной процедурой и сопровождается риском выкидыша (~1−2%). Амниоцентез (пункция амниотической оболочки) и кордоцентез (взятие крови из пуповины) также характеризуются высокой точностью результатов (чувствительность >99%). Такая инвазивная диагностика производится во втором триместре беременности и имеет риск прерывания беременности также около 1%.

Современная диагностика:

NIFTY — новый, оригинальный, высокотехнологичный, очень точный и чувствительный тест для неинвазивной пренатальной диагностики плода. В основе теста лежит анализ ДНК плода, находящейся в крови матери.

NIFTY — неинвазивная пренатальная диагностика по ДНК плода в крови матери позволяет очень точно (>99,9%) установить наличие или отсутствие наиболее частой хромосомной патологии — синдромов Дауна, Эдвардса и Патау, а также определить пол ребенка.

Когда проходить тест

Неинвазивную пренатальную диагностику с помощью теста NIFTY можно проводить уже с 9-й недели беременности. На более ранних сроках в крови матери может оказаться слишком мало ДНК плода для уверенного заключения, а надёжность — одно из главных достоинств теста NIFTY.

Необходимо помнить, что после 9-ти недель беременности тест можно проводить на любом сроке. Но проведение неинвазивной пренатальной диагностики после 24 недель беременности оставляет слишком мало времени до родов, чтобы сделать уточняющую инвазивную диагностику в случае обнаружения анеуплодии.

Что такое пренатальная диагностика

Пренатальная диагностика плода — это диагностика на этапе внутриутробного развития. Современная пренатальная диагностика плода включает инвазивные и неинвазивные методики, которые позволяют выявить большинство врожденных и наследственных патологий плода, например хромосомные нарушения или нарушения в работе сердца, а также произвести подтверждение отцовства и определить пол ребенка.

В число методов пренатальной диагностики входит анализ родословной родителей и их генетический анализ, а также инвазивные и неинвазивные тесты. В число инвазивных методик входит биопсия хориона (забор эмбриологических структур) для выявления хромосомных и моногенных болезней, амниоцентез (забор околоплодных вод) для цитогенетического и молекулярного анализа различных заболеваний, кордоцентез (забор крови из пуповины) для выявления гемолитической болезни и резус-конфликта. Инвазивная диагностика сопровождается риском выкидыша и рекомендована только при наличии показаний.

Среди неинвазивных методов пренатальной диагностики распространен скрининг материнских сывороточных факторов, ультразвуковой скрининг, а с недавних пор также тесты на основе анализа генетического материала плода, полученного из крови матери. Современные неинвазивные исследования позволяют выявить хромосомные нарушения, а также аномалии в развитии плода без риска для здоровья матери и ребенка.

Наиболее распространенные хромосомные нарушения

Наиболее часто встречающимися хромосомными нарушениями являются трисомии — синдром Эдвардса, синдром Патау и синдром Дауна. При данных заболеваниях возможно только симптоматическое лечение, а выздоровление пациентов невозможно. В настоящее время тесты на определение синдрома Дауна, а также другой распространенной врожденной патологии проводят согласно программе скринирующего обследования всех беременных. Такие программы опираются на данные биохимических анализов и УЗИ. К сожалению, чувствительность этих методов не превышает 80%, т.е. сохраняется высокий риск (20%) пропустить заболевание, и при этом обычные тесты в 5% случаев ошибочно определяют болезнь, когда её нет.

Синдром Эдвардса — трисомия по хромосоме 18. Данная трисомия является следствием увеличения копий хромосомы 18. Как правило, продолжительность жизни детей с синдром Эдвардса не превышает одного года. Синдром вызывает как физические отклонения — аномалии мозгового и лицевого черепа, деформирование ушных раковин, аномальное развитие стоп, так и психики — синдром вызывает глубокую олигофрению.

Синдром Патау. Данный синдром сопровождается тяжелыми врожденными пороками и был впервые описан в 1657 г. Э. Бартолином, а свое название получил в честь доктора Клауса Патау, который выявил его хромосомную природу в 1960 г. Синдром может сформироваться по двум цитогенетическим вариантам: простая трисомия (по хромосоме 13) и робертсоновская транслокация. Другие варианты встречаются крайне редко.

Трисомия по хромосоме 21 (синдром Дауна) является самым распространенным нарушением числа хромосом, поэтому тесты на определение синдрома Дауна являются самыми частыми среди рекомендованных в пренатальный диагностике. Синдром сопровождается различными внешними признаками, а также задержками умственного и речевого развития.

Что значит «синдром Дауна»

Синдром Дауна — это хромосомная аномалия, которая заключается в увеличенном количестве хромосом. При данной аномалии кариотип представлен 47 хромосомами, тогда как нормальным является наличие 46 хромосом. В данном случае наблюдается трисомия хромосомы 21 — вместо пары хромосом 21 в каждой клетки находится три хромосомы 21. В редких случаях синдром Дауна обусловлен увеличением числа отдельных частей хромосомы 21 или наличием трисомий не во всех клетках организма (мозаицизм).

Синдром получил свое название в честь английского врача, впервые его описавшего — Джона Дауна. Описания Джона Дауна датируются 1866 годом, однако непосредственная связь между синдромом и количеством хромосом была выявлена французским генетиком Жеромом Леженом только в 1959 году. Синоним — трисомия 21.

Трисомия 21 возникает в результате появления лишней хромосомы в процессе образования половых клеток (гаметогенеза) как матери, так и отца. Для синдрома Дауна характерно увеличение риска появления аномалии с возрастом беременной. Наиболее резкое увеличение риска происходит в возрасте после 35 лет, и далее риск продолжает быстро увеличиваться, как считается в связи со старением основной массы яйцеклеток. Синдром Дауна является врожденным заболеванием, но его не относят к наследственным заболеваниям, т.к. в данном случае патология не передаётся от родителей потомству, но возникает во время гаметогенеза.

Синдром Дауна сопровождается внешними изменениями, такими как плоское лицо с раскосыми глазами, низкий рост, деформация черепа (брахицефалия), гиперподвижность суставов, мышечная гипотония и т.д. Также синдром Дауна, как правило, приводит к умственной отсталости.

Что такое трисомия

Трисомия — это хромосомная аномалия, представляющая собой наличие одной дополнительной хромосомы к какой-либо паре хромосом, что является следствием нерасхождения гомологичных хромосом. Это нарушение числа хромосом, позволяет выявить уже на раннем сроке беременности неинвазивный пренатальный тест NIFTY, а также, другие инвазивные методики, например амниоцентез.

Трисомия относится к хромосомным болезням. Частота хромосомных наследственных патологий согласно данным цитогенетических иссле¬дований, проводимых среди новорожденных, составляет порядка 0,5%.

Нарушения, вызванные численными мутациями хромосом, приводят к тяжелым генетическим заболеваниям. При аутосомных трисомиях наиболее часто встречаются трисомия 21 (синдром Дауна), трисомия 18 (синдром Эдвардса), трисомия 13 (синдром Патау). Перечисленные синдромы являются аутосомными трисомиями; согласно исследованиям, другие трисомики чаше всего нежизнеспособны и теряются в виде спонтанных абортов, так как несовместимы даже с ранними этапами эмбриогенеза.

В настоящее время существует ряд диагностических методик — включая неинвазивный пренатальный тест и инвазивные методики, — которые позволяют выявить трисомию и другие хромосомные аномалии на ранних сроках беременности с высокой степенью точности.

Этапы диагностики NIFTY

NIFTY — это неинвазивная пренатальная диагностика, для выполнения которой необходимо пройти ряд этапов от предварительной консультации и до получения результатов. Первый этап — это консультация со специалистом. В ходе консультации предоставляется вся основная информация о тесте, определяется необходимость его выполнения и возможные ограничения.

По итогам консультации выбирается оптимальное время для выполнения теста NIFTY, которое входит в большой промежуток от момента достаточной концентрации фрагментов ДНК плода в крови матери (на 9 неделе беременности) до 24 недели, когда уже не остается времени для инвазивной диагностики, в случае необходимости.

Вторым этапом идет подписание документов об информированном согласии. На данном этапе матери предоставляется форма информированного согласия NIFTY. После подписания согласия, выполняется забор венозной крови в объеме 10 мл. Забор крови — это безопасная процедура, которая не влияет на плод и хорошо переносится беременными.

Далее производится отправка крови в лабораторию BGI. В лаборатории выполняется тестирование образца, и подготавливается заключение, которое дает вероятность более 99,6% позитивного или негативного результата.

Заключительный этап — передача результатов. Результаты тестирования можно получить у своего врача уже через 10 — 14 дней после процедуры. Далее, в зависимости от результата, который дала высокоточная неинвазивная пренатальная диагностика, врач помогает определить дальнейшие действия.

Преимущества NIFTY

Неинвазивная пренатальная диагностика с помощью теста NIFTY позволяет провести анализ уже с 9 недель беременности.

Тест безопасен для малыша и может быть проведён по желанию женщины.

Надёжность теста подтверждена его использованием в различных странах: Австрия, Великобритания, Венгрия, Греция, Дания, Израиль, Испания, Кипр, Польша, Румыния, Турция, Чехия.

По данным на февраль 2014 года в мире проведено более 250 000 тестов NIFTY. Такое огромное количество проведенных тестов позволяет с высокой уверенностью говорить о беспрецедентно высоких специфичности (99,99%) и чувствительности (99,65%) теста.

Непревзойдённая скорость анализа — ответ можно получить уже через 8 дней после получения образца в лаборатории.

Кому рекомендован тест

Неинвазивная пренатальная диагностика с помощью NIFTY показана женщинам:

1. Желающим получить надежную информацию о наличии или отсутствии синдромов, связанных с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, Х и Y.
2. Старше 35 лет, которым противопоказаны инвазивные методы, или которые не хотят проводить инвазивную диагностику (риск синдрома Дауна резко возрастает после 35 лет).
3. У которых биохимические тесты или УЗИ на 1 и 2 триместрах свидетельствуют о повышенном риске синдрома Дауна.
4. При невозможности проведения инвазивной диагностики вследствие предлежания плаценты, риска выкидыша, инфекции HBV или HIV.
5. Вынашивающих беременность после ЭКО.

Что такое «инвазивный» и «неинвазивный» тест

В пренатальной диагностике под инвазивным подразумевают тесты, требующие взятия эмбриональных тканей:

• хорионбиопсия — взятие маленького фрагмента хориона,
• амниоцентез — прокол через брюшную стенку и взятие нескольких миллилитров амниотической жидкости,
• кордоцентез — прокол через брюшную стенку и взятие крови плода из сосудов пуповины.

Все эти методы несут риск инфицирования плода и прерывания беременности.

Неинвазивными называют методы, которые не затрагивают ткани и органы плода, включая УЗИ и взятие крови из вены у матери. Данные методы безопасны для плода.

NIFTY является новым точным и надёжным методом неинвазивной прентальной диагностики.

Хромосомы и ДНК

В соматической клетке человека находится 23 пары хромосом. Потеря или приобретение хотя бы одной хромосомы приводит к развитию врожденных пороков развития. Трисомии по хромосоме 21 (синдром Дауна), 18 (синдром Эдвардса) и 13 (синдром Патау) — наиболее распространённые хромосомные нарушения.

Тест NIFTY, разработанный компанией BGI и широко распространённый в мире позволяет с высокой точностью определить наличие или отсутствие этих анеуплоидий. Для этого необходимо взять 10 мл крови беременной в срок от 10 до 24 недель. В этом образце крови есть, так называемая, внеклеточная ДНК, которая попала в кровь матери из организма плода.

Подробный анализ всей внеклеточной ДНК на современном высокопроизводительном оборудовании позволяет выделить ДНК плода и определить число хромосом 13, 18 и 21, а также половых хромосом, что также даёт информацию о поле плода.

Что такое анеуплоидия

Анеуплоидия — изменение числа хромосом. В норме у человека 23 пары хромосом. При анеуплоидии может как исчезать одна из хромосом пары, так и появляться лишняя. Парность хромосом очень важна для нормального развития и жизни человека, и анеуплоидии большинства хромосом летальны для эмбриона на очень ранних сроках развития (дни-недели).

Однако, есть анеуплоидии, совместимые с жизнью. Самая известная — трисомия (то есть вместо пары — три) хромосомы 21 — приводит к развитию синдрома Дауна.

NIFTY — метод неинвазивной пренатальной диагностики — разработан специально для определения наличия или отсутствия анеуплоидии у плода уже с 9-ти недель беременности.

Сочетание надёжности, безопасности и скорости делает NIFTY лучшим выбором для каждой беременной.

Как делают тест NIFTY

Для проведения неинвазивной пренатальной диагностики NIFTY необходимо взять 10 мл крови беременной. После этого из крови выделяют свободную (внеклеточную) ДНК, в которой среди фрагментов ДНК матери находятся фрагменты ДНК плода.

Начиная с 9-ой недели беременности фрагментов ДНК плода достаточно много, чтобы проанализировать их и уверенно отличить плодные от материнских. По плодным фрагментам ДНК можно определить количество каждой хромосомы плода.

Наиболее важными с клинической точки зрения являются хромосомы 21, 18, 13 и половые X и Y. Именно их число анализируют в тесте NIFTY.

Ограничения NIFTY

У любого медицинского исследования есть ограничения и противопоказания к применению.

При проведении NIFTY необходимо помнить, что следующие условия могут повлиять на его точность: переливание крови, трансплантация, иммунотерапия или терапия стволовыми клетками в анамнезе у беременной. Мозаицизм* матери, плаценты или плода может приводить к ошибочным результатам. Частота таких случаев не превышает десятой доли процента.

Мозаицизм — сочетания разных по генотипу клеток в пределах одной ткани, органа или организма. В данном случае имеется в виду сочетание нормальных клеток и клеток с анеуплоидией.

Что такое амниоцентез

На сегодняшний день пренатальная диагностика, позволяющая выявить ряд патологических состояний плода, получает все большее распространение. Среди инвазивных процедур чаще всего проводится амниоцентез — прокол через брюшную стенку и взятие нескольких миллилитров амниотической жидкости в 16−20 (оптимально) недель беременности. При подозрении на генетически обусловленное заболевание, амниоцентез выполняется на более ранних сроках.

Пункция амниотической оболочки позволяет произвести забор околоплодных вод для проведения диагностических исследования, а также амниоцентез дает возможность выполнить интраамниальное введение препаратов, амниоредукцию, фетохирургию и т.д.

Амниоцентез позволяет производить исследования, включая биохимические, гормональнальные, иммунологические и цитологические, для получения необходимой информации о состоянии плода в 1−3 триместрах беременности.

В числе прочего процедура амниоцентеза производится для выявления трисомии с высокой точностью результатов. Однако проведение такого анализа связано с риском выкидыша (около 1%), а рекомендуемое время для проведения данного теста 16−20 недель беременности. Также существенным недостатком такого исследования является продолжительное ожидание результатов — до нескольких недель. Это значительно сокращает время на принятие решения в случае выявления патологии и повторного исследования, а пренатальная диагностика имеет своей основной задачей как можно более ранее выявления отклонений.

Неинвазивный пренатальный тест Panorama: Специалистам

ТЕСТ ДЛЯ ПРЕНАТАЛЬНОГО СКРИНИНГА PANORAMA™

Panorama — неинвазивный пренатальный тест (NIPT), которым анализируется фетально-плацентарная внеклеточная ДНК (вкДНК), выделенная из плазмы крови матери и выполняется скрининг на различные фетальные хромосомные аномалии. К этим аномалиям относятся анеуплоидии трисомия 21 (синдром Дауна), трисомия 18 (синдром Эдвардса), трисомия 13 (синдром Патау), моносомия X (синдром Тернера), трисомии половой хромосомы (XXX, XXY, XYY), триплоидия и пять синдромов микроделеций, включая делецию 22q11.2 (Ди Джорджи), синдром кошачьего крика, Прадера — Вилли, Ангельмана и делецию 1p36.1-5 Если запрошено, будет также указан пол плода. Panorama может проводиться с высокой точностью, начиная с девяти недель беременности.

ЧАСТОТА ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ

Трисомия 21, трисомия 18 и трисомия 13 — три наиболее распространенных анеуплоидии, которые в общей сложности возникают примерно в 1 случае на 450 живорождений. В РК по данным Национального Генетического регистра в 2015 г. частота этих трисомий составила 1 на 705 новорожденных.Из них наиболее частым является синдром Дауна – или трисомия по 21 хромосоме. Микроделеции или микроскопические участки потерь хромосомного материала, встречаются у новорожденных гораздо чаще, чем предполагалось ранее. Совокупная частота пяти синдромов микроделеций, охватываемых тестом Panorama, при рождении составляет приблизительно 1:1000. Наиболее распространенная клинически значимая микроделеция, синдром микроделеции 22q11.2 или синдром Ди Джорджи, встречается чаще, чем муковисцидоз (рисунок 1).

ТРАДИЦИОННЫЕ СКРИНИНГОВЫЕ МЕТОДЫ

До недавних пор основной вариант пренатального (дородового) генетического скрининга на хромосомные нарушения плода включал в себя определение концентрации биохимических маркеров в сыворотке крови матери в первом и/или втором триместре беременности, в сочетании с ультразвуковым исследованием в первом триместре для измерения ультразвуковых маркеров хромосомных аномалий — толщины шейной складки (ТВП) и/или длины костей носа (ДКН). Хотя этот комбинированные скрининговый тест был разработан для выявления трисомии 21 у плода, он способен также обнаруживать трисомию 18 и трисомию 13. Повышенное ТВП (а также кистозная гигрома и другие УЗ маркеры) также могут являться косвенными признаками возможной хромосомной патологии плода (иногда их обнаруживают при микроделеции 22q11.2). Данные мультицентровых исследований, методы доказательной медицины подтверждают, что традиционными скрининговыми тестами можно пренатально выявить только 79–90% синдромов Дауна с частотой ложноположительных результатов 4–5%. Диагностическая ценность положительного результата (PPV) — т. е., вероятность, что результат высокого риска по тесту укажет истинный положительный результат у пациента — для трисомии 21 с использованием традиционных скрининговых методов составляет НЕИНВАЗИВНОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ ФЕТАЛЬНЫХ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК

Революцию в скрининге на ПЛОДОВЫЕ хромосомные нарушения совершили неинвазивные пренатальные тесты, анализирующие внеклеточную (вкДНК) в плазме крови матери. Поскольку фетальная вкДНК проходит через плацентарный барьер и поступает в кровоток матери, простой забор крови у матери обеспечивает возможность обнаружить фетальные копии хромосом, не подвергая плод рискам, связанным с проведением инвазивных процедур. Анализируемая вкДНК представляет собой смесь ДНК матери и плода, процент ДНК плода называется «фетальная фракция». Было показано, что фетальная фракция положительно коррелирует со сроком беременности и отрицательно коррелирует с весом матери.

Точное определение фетальных копий хромосом с использованием вкДНК, изолированной из плазмы крови матери, требует амплификации вкДНК и последующего биоинформационного анализа. На настоящий момент имеется два основных биоинформационных подхода: «количественные» методы или методы подсчета хромосомного материала первого поколения, используемые большинством тестов, основанных на вкДНК, и подход второго поколения, используемый Natera, который включает в себя метод генотипирования, основанный на анализе однонуклеотидных полиморфизмах (ОНП).

ПЕРВОЕ ПОКОЛЕНИЕ: МЕТОДОЛОГИЯ ПОДСЧЕТА

Количественные методы подсчета основаны на сравнении относительного количества считанных последовательностей от интересующей хромосомы, например хромосомы 21 (трисомия по которой приводит к синдрому Дауна) с эталонной хромосомой или набором хромосом, для которых предполагается эуплоидность (нормальное число хромосом). Хотя этот подход эффективен для обнаружения трисомии 21 и трисомии 18, он с меньшим успехом обнаруживает трисомию 13 или нарушения числа половых хромосом. Метод подсчета не способен обнаружить триплоидию (увеличение в три раза общего числа хромосом), которая, по оценкам ученых, возникает приблизительно в 1 случае на 2000 беременностей до 12 недель и которая может привести к тяжелым аномалиям плаценты и плода, а также связана с повышенными рисками спонтанного аборта, пре-эклампсии и гестационной трофобластической неоплазии (онкологии). Метод подсчета также не способен различать генотипы матери и плода, что может стать проблемой в случае дупликаций (хромосомных аномалий) у матери. Этот метод также не дает возможности обнаружения синдрома «исчезающей двойни»; любых других хромосомных аномалий матери, что приводит к ложноположительным результатам (ложный диагноз хромосомных нарушений) для плода. Так как фетальная фракция вкДНК на самом деле происходит из плаценты, существуют случаи, когда фетальная и плацентарная ДНК генетически различаются вследствие ограниченного хромосомного «плацентарного мозаицизма». Этот тип «мозаицизма» возникает при 1–2% беременностей и может являться причиной ложноотрицательных и ложноположительных результатов как для методологии подсчета, так и для методологии, основанной на ОНП.

ВТОРОЕ ПОКОЛЕНИЕ: МЕТОДОЛОГИЯ, ОСНОВАННАЯ НА ОНП

тест Panorama является единственным доступным подходом НЕИНВАЗИВНОГО пренатального скрининга (NIPT), основанном на ОНП для определения плоидности (числа хромосомного набора). Этот подход различает ДНК матери от фетальной ДНК в плазме, осуществляет секвенирование и анализирует фетальную ДНК. Это обеспечивает более надежные данные о генотипе плода и более высокую точность при фетальных фракциях от 2,8% и более. Тест Panorama использует для генотипирования 13 392 ОНП, охватывающих хромосомы 21, 18, 13, X и Y; дополнительные наборы ОНП являются целью для обнаружения 5 микроделеций. После генотипирования используется запатентованный алгоритм скрининга на наличие фетальных хромосомных аномалий и пол плода. Способность различать вкДНК матери и плода также позволяет Panorama идентифицировать синдром «исчезающей двойни» и хромосомной дупликации матери, что приводит к идентификации ранее не выявленной микроделеции, например, наличие синдрома микроделеции 22q11.2 у самой матери. Так как для теста Panorama не требуется эталонная хромосома, он уникальным образом способен обнаруживать триплоидию и полностью нормальную беременность.

Валидационное исследование на хромосомы 13, 18, 21, X и Y показало значения чувствительности 100% для трисомии 21 и трисомии 13 — 96%; для трисомии 18 — 90%; для моносомии X; по каждому показанию к применению были получены значения специфичности не менее 99,9%.

В валидационном исследовании ДЛЯ дородовой диагностики микроделеций сообщались значения чувствительности более 97% и значения специфичности более 99% для каждого из 5 видов микроделеций. Клиническая валидация обнаружения микроделеций продолжается в настоящее время.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Тест Panorama можно пройти, начиная с девяти недель беременности. Для него требуется всего лишь образец крови матери. Для отбора образцов используются специальные пробирки для сбора крови, защищающие вкДНК. Образцы отправляются при комнатной температуре в сертифицированную CLIA и CAP лабораторию Natera в Сан-Карлосе, Калифорния, США. После анализа образцов составляется отчет, в котором указаны индивидуальные генетические риски для каждой из оцениваемых хромосом. Если запрошен, сообщается пол плода. Если заказаны, также приводятся индивидуальные уровни риска для синдромов микроделеций. Если тест Panorama выявил высокий риск, рекомендуются последующие медико-генетическое консультирование и уточнение точного генетического диагноза внутриутробного плода путем проведения диагностической инвазивной процедуры.

Как валидационное исследование, так и клиническое валидационное исследование для Panorama содержали большую выборку женщин из общей популяции беременных, и , как показали эти исследования уровень точности PPV анализа Панорама был абсолютно одинаковым для беременных с высоким и низким генетически риском по возможной хромосомной патологии плода. Так как микроделеции возникают вне зависимости от возраста матери и других традиционных факторов риска, тест Panorama может являться полезным надежным скрининговым инструментом для всей беременных женщин.

ВЫВОДЫ

Тест Panorama имеет высокую чувствительность и специфичность для обнаружения трисомии 21, трисомии 18, трисомии 13, моносомии X, триплоидии и для определения пола плода и обеспечивает раннее подтверждение. Этот скрининговый тест также способен обнаружить присутствие трисомий половых хромосом. По сравнению с традиционными скрининговыми методами, низкая частота ложноположительных результатов теста Panorama может сократить количество инвазивных диагностических процедур, на которые решаются женщины. Тест Panorama также был валидован как скрининговый инструмент для наиболее распространенных микроделеций, включая делецию 22q11.2 (Ди Джорджи), делецию 1p36, синдромы кошачьего крика, Прадера – Вилли и Ангельмана. Для будущих родителей, желающих узнать больше о здоровье ребенка, тест Panorama предлагает имеющий высокую точность неинвазивный способ скрининга на наиболее распространенные хромосомные аномалии на ранних сроках беременности.

ПГД эмбрионов, преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов

Каждая из 100 триллионов клеток в организме человека (за исключением красных кровяных клеток) содержит весь человеческий геном. Хромосомы – это струноподобные элементы внутри ядра (в центре) каждой клетки вашего тела. Они содержат генетическую информацию, ДНК. Ген занимает определенное место на хромосоме. В норме, есть 23 идентичных пары хромосом (2 метра ДНК) в каждой клетке, в общей сложности 46 хромосом. Каждый партнер во время оплодотворения обычно предоставляет 23 хромосомы. Если яйцеклетка или сперматозоид имеют аномальную упаковку хромосом, эмбрион, который они создают, также будет иметь хромосомные аномалии. Иногда это связано с перестройкой хромосом, или недостатком части хромосомы. В некоторых случаях есть отсутствующие хромосомы, или дополнительная хромосома (анеуплоидии), ведущие к наследственным заболеваниям. Любой эмбрион, в котором отсутствует хромосома (моносомия) перестанет расти до имплантации (фатальная аномалия). Если анеуплоидии включают хромосомы 13, 18, 21, Х или Y, беременность может дойти до родов. Наиболее распространенной из этих несмертельных аномалий является трисомия 21, или синдром Дауна, при которой присутствует дополнительная 21-я хромосома. Другие включают синдром Тернера у женщин и синдром Клайнфельтера у мужчин.

История преимплантационной генетической диагностики (ПГД)

Первые живорождения после ПГД были зарегистрированы в Лондоне в 1989 году. Две двойни девочек-близнецов родились от пяти пар с риском передачи связанного с Х-хромосомой заболевания. В настоящее время с помощью методов генетического анализа или ПГД могут быть обнаружены около 90% аномальных эмбрионов. Не все хромосомные или генетические заболевания могут быть определены этими процедурами, так как в ходе одной процедуры может быть диагностировано только ограниченное число хромосом. Многочисленные исследования на животных и некоторые исследования на человеке показывают, что микрохирургия эмбриона (биопсия), необходимая для удаления клеток, не влияет на нормальное развитие ребенка. Эта процедура, однако, была выполнена относительно небольшому числу пациентов во всем мире, поэтому точные негативные последствия, если таковые имеются, неизвестны. Несмотря на то, что после генетического анализа для выявления анеуплоидии всем мире на сегодняшний день было рождено уже много детей, эта процедура все еще относительно нова. В исследованиях на животных не было обнаружено никаких очевидных проблем и предварительные данные с эмбрионами человека позволяют предположить справедливость этого вывода. В исследовании, проведенном в Университетском колледже Лондона, исследователи недавно рассмотрели 12 преимплантационных эмбрионов с новой техникой, которая сочетает в себе амплификацию всего генома (WGA) и сравнительную гибридизацию генома (CGH). В результате в 8 из 12 изученных эмбрионов были обнаружены значительные хромосомные аномалии. Это может объяснить, почему люди имеют в лучшем случае 25% шансов на достижение жизнеспособной беременности в месяц при естественном зачатии.

Как передаются по наследству генетические заболевания

В диаграммах ниже, D или d представляет дефектный ген, а N или n представляет нормальный ген. Мутации не всегда приводят к болезни.

Доминантные заболевания:

Один из родителей имеет один дефектный ген, который доминирует над своей нормальной парой. Так как потомки наследуют половину своего генетического материала от каждого из родителей, есть 50% риск наследования дефектного гена, и, следовательно, заболевания.

Рецессивные заболевания:

Оба родителя являются носителями одного дефектного гена, но при этом имеют нормальную пару гена. Для наследования заболевания необходимы две дефектных копии гена. Каждый потомок имеет 50% шанс быть носителем, и 25% шанс унаследовать заболевание.

X-сцепленные заболевания:

Нормальные женщины имеют XX хромосомы, а нормальные мужчины XY. Женщины, которые имеют нормальный ген на одной из Х-хромосом, защищены от дефектного гена на их другой Х-хромосоме. Однако, у мужчины отсутствует такая защита в связи с наличием только одной Х-хромосомы. Каждый мужской потомок от матери, которая несет в себе дефект, имеет 50% шанс унаследовать дефектный ген и заболевание. Каждый женский потомок имеет 50% шанс быть носителем, как и ее мать. (на рисунке ниже X представляет нормальный ген а X представляет дефектный ген)

Возможные преимущества генетического анализа

Преимплантационная генетическая диагностика позволяет отобрать и перенести не измененные (хромосомно нормальные) эмбрионы, которые могут привести к большей частоте имплантации на эмбрион, сокращению потерь беременности и рождению большего числа здоровых детей. Генетическая диагностика предлагает парам альтернативу мучительному выбору по поводу того, чтобы прервать пострадавшую беременность после пренатальной диагностики, производимой путем амниоцентеза или биопсии ворсин хориона (CVS) на более поздних стадиях беременности. Почти все генетически связанные заболевания, которые могут быть диагностированы в перинатальном периоде либо амниоцентезом или CVS, могут быть обнаружены и ПГД. Процедура должна уменьшить психологическую травму для пар, которые несут повышенный риск генетических заболеваний для потомства.

Преимущества преимплантационной генетической диагностики (ПГД) могут включать в себя:

• Была выдвинута гипотеза, что негативный отбор анеуплоидных эмбрионов позволит улучшить частоту имплантации, из-за корреляции между старшим возрастом матери и хромосомно аномальными эмбрионами. Хромосомно нормальные эмбрионы имеют в перспективе более высокие шансы на развитие. При переносе только хромосомно нормальных эмбрионов в матку, ваши шансы на невынашивание могут уменьшиться, а ваши шансы забеременеть могут увеличиться. Двадцать один процент спонтанных абортов обусловлены численными хромосомными нарушениями, и основным фактором риска является возраст матери. Трисомии увеличиваются с 2% у женщин 25 лет до 19% у женщин старше 40 лет. По данным ASRM-SART, 52% циклов ЭКО в США осуществляется для женщин 35 лет и старше, что показывает, что популяция ЭКО может получить большую пользу от скрининга хромосомных анеуплоидий. Важно отметить, что вероятность наступления беременности и родов здоровым ребенком, однако, снижается у пациентов старше 34 лет (как правило, менее 50%) из-за проблем, связанных с процедурой ЭКО.
• ПГД в состоянии идентифицировать большинство хромосомных аномалий с риском развития до родов. В настоящее время применяется ПГД хромосомных аномалии для X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 и 22 хромосом. Это составляет 70% анеуплоидий, обнаруживаемых при спонтанных абортах.
• Вполне возможно, что некоторая информация о ваших собственных яйцеклетках и эмбрионах может быть полезной для вас в случае дальнейших попыток ЭКО, или поможет объяснить прошлые неудачи при естественном зачатии или ЭКО.
• Будущие пациенты могут извлечь выгоду из информации, полученной от ПГД о связи между хромосомами, неразвивающимися или неимплантирующимися эмбрионами.

Возможные риски генетического анализа

• В лучшем случае, с помощью методов ПГД могут быть обнаружены около 90% от аномальных эмбрионов.
• Относительно большое число яйцеклеток или эмбрионов могут быть признаны ненормальными и поэтому для переноса останется только несколько эмбрионов. В некоторых случаях (11%), может не быть нормальных яйцеклеток или эмбрионов. В этих случаях перенос эмбриона не рекомендуется. Хотя это и разочаровывающий результат, вполне вероятно, что цикл ЭКО без ПГД не привел бы к беременности или привел бы к аномалиям у плода.
• Клетки, которые будут удалены, изучаются с помощью специализированных новых методов. Такие процедуры иногда не могут быть проведены из-за технических сложностей.
• Не все хромосомные или генетические отклонения могут быть определены пир помощи данных методов, так как в ходе одной процедуры может быть диагностировано только ограниченное число хромосом.
• Вполне возможно, что нормальный эмбрион может быть неправильно определен как ненормальный, и не перенесен, или что аномальный эмбрион неправильно определен как нормальный и будет перенесен в матку. (ПГД в настоящее время не является заменой для пренатальной диагностики. Рекомендуется проведение пренатальной диагностики для подтвердения диагноза).
• При удалении клеток может случайно произойти повреждение эмбриона (0,1%).
• Неявные технические обстоятельства в лаборатории могут привести к неудаче процесса тестирования, что приводит к отсутствию результатов. Неудача процесса тестирования не оказывает никакого влияния на ваш эмбрион. В этом случае, эмбрионы для переноса будут отобраны на основе существующих критериев.
• Анализ одной клетки имеет свои ограничения. Иногда, хромосомные аномалии находятся в одной клетке, но не в других клетках того же эмбриона, или наоборот, что выражается мозаицизмом. Это может привести к переносу аномального эмбриона, или к отказу от нормального эмбриона.
• ПГД для определения транслокаций может определить наличие или отсутствие определенных хромосомных нарушений, но не может ни определить генетическое заболевание, ни предсказать генетические уродства.
• Даже после успешной процедуры ПГД беременность может не наступить.

Кандидаты для биопсии эмбриона и ПГД

Кандидаты для биопсии эмбриона и ПГД включают в себя:

• Женщины старше 34 лет: женщины рождаются со всеми яйцеклетками, которые они будут когда-нибудь иметь, и по мере старения женщины ее яйцеклетки подвергаются также воздействию этого процесса старения. Таким образом, вероятность зачатия хромосомно аномального потомство с возрастом увеличивается. В целом риск анеуплоидии увеличивается с 1 на 385 в возрасте 30 лет, до 1 на 179 в возрасте 35 лет, до 1 на 63 в возрасте 40 лет, и в возрасте до 45 лет возможность рождения больного ребенка составляет 1 к 19. В результате использования ПГД при ЭКО стало известно, что в действительности больее чем 20% эмбрионов у женщин в возрасте от 35 до 39 анеуплоидны, и страдают почти 40% эмбрионов у женщин старше 40 лет. Большинство из этих эмбрионов в случае переноса в матку либо не имплантируются или приводят к невынашиванию. Это считается основной причиной низкой частоты наступления беременности и родов женщин в возрасте 40 лет и старше. До внедрения ПГД, для увеличения шансов на зачатие в матку переносилось большее число эмбрионов. По-прежнему настоятельно рекомендуется проведение пренатальной диагностики после цикла ЭКО, поскольку это подтверждает прогноз нормального потомства. Возможно также, что аномальные эмбрионы могут быть ошибочно определены как нормальные и перенесены в матку.
• Женщины с рецидивирующей потерей беременности (привычным невынашиванием): мужчина или женщина пары может иметь ненормальную упаковку хромосом, что может вызвать фатальные аномалии в некоторых беременностях, но не в других.
• Пары с транслокациями: транслокации – это изменения в конфигурации хромосом, при которых хромосомы прикрепляются друг к другу (робертсоновские) или участки разных хромосомах меняются местами (взаимные или реципрокные). Примерно 1 из 900 человек имеет робертсоновские транслокации с участием хромосом 13, 14, 15, 21, 22. Примерно 1 из 625 человек имеет взаимные транслокации. Для выявления наличия транслокаций может быть проведено кариотипирование обоих партнеров. Пары с транслокациями могут иметь периодические потери беременности, или потомство с психическими или физическими проблемами. При сбалансированной транслокации, когда нет дополнительного или отсутствия хромосомного материала, и разрыв в хромосоме не нарушает функции генов, человек не страдает. Носители сбалансированных транслокаций могут быть затронуты сложными врожденными пороками развития, которые могут или не могут быть связаны с наследственным заболеванием. При несбалансированной транслокации, при которой существует или отсутствует дополнительный материал хромосом, отдельные личности, как правило, не будут затронуты, хотя у некоторых будет наблюдаться снижение фертильности. Однако существует риск того, что яйцеклетки или сперматозоиды от такого человека могут иметь несбалансированные транслокации, в результате чего эмбрион будет несбалансированным. Это может привести к неудаче имплантации, повторному невынашиванию, или потомству с психическими или физическими проблемами.
• Пары с аутосомно-доминантными заболеваниями, при которых будут затронуты 50% эмбрионов. Пары, которые имеют данные нарушения в семейном анамнезе, или являются носителями, или страдают от наследуемых заболеваний.

Пары с повторными неудачами ЭКО.

• Пары с историей бесплодия могут быть в состоянии определить этиологию, и, следовательно, выбрать соответствующее лечение.
• Парам из группы риска для наследования потомством болезни с угрозой для жизни, болезни с поздним началом (болезнь Хантингтона), предпочтительно планировать, выбрать соответствующие методы лечения, или ускорить процесс диагностики (например, ранней диагностики рака молочной железы)
• Пары, желающие потомство для производства HLA-совпадающих стволовых клеток, для страдающего ребенка со смертельным заболеванием.

Используемые методы

Для анализа на наличие генетических дефектов эмбриона, из него необходимо удалить либо первое полярное тельце из неоплодотворенной яйцеклетки и/или 1 или 2 клетки от каждого эмбриона. Это называется биопсией яйцеклетки или эмбриона и обычно делается перед тем, как происходит оплодотворение, или через 3 дня после оплодотворения. Биопсия на 6-10 клеточной стадии не оказывает отрицательного влияния на преимплантационное развитие. На этом этапе каждая клетка имеет полный набор хромосом. Обычно из эмбриона удаляется только одна клетка, так как ожидается, что будут одинаковыми со всеми другими клетками в эмбрионе. Иногда необходимо удалить вторую клетку из эмбриона, например, если сигнал в первой не обнаружен. Для диагноза предрасположенности с помощью первого и второго полярных телец, как показателей генетического статуса яйцеклетки, используется анализ методом FISH. Недостатком анализа полярных телец заключается в том, что он не принимает во внимание отцовские анеуплоидии.

Анализ биопсированной клетки использует один из двух методов:

• Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH): биопсированная клетка фиксируется на предметном стекле, нагревается и охлаждается, и ее ДНК «помечается» цветными флуоресцентными красителями, называемыми зондами (маленькие кусочки ДНК, которые соответствуют исследуемым хромосомам), по одному для каждой определяемой хромосомы. В настоящее время может быть идентифицировано 8 из 23 хромосом. После завершения эмбриолог учитывает цвета под мощным микроскопом и в состоянии, в большинстве случаев, отличить нормальные от аномальных клеток. Этот процесс занимает около суток. Нормальные эмбрионы будут либо перенесены в матку на 4-й день после поиска яйцеклеток, или подвергнутся продленному культивированию и будут перенесены на 5-й день, как бластоцисты. Клетки, использовавшиеся для ПГД, больше не жизнеспособны, и не будут возвращены в эмбрион, но могут быть сохранены для будущих исследований.
• Полимеразная цепная реакция (ПЦР): методика, которая увеличивает количество копий специфичных регионов ДНК, чтобы произвести достаточное для анализа количество ДНК. ДНК является двухцепочечной (за исключением некоторых вирусов), и две цепи соединяются очень специфическим образом. «Последовательность кирпичиков» генов представляет собой определенный порядок появления 4-х различных дезоксирибонуклеотидов в сегменте ДНК. Эти 4 компонента: аденин (А), тимидин (T), цитозин (C), и гуанин (G). Последовательность этого 4-буквенного алфавита генерирует состав гена. При этой методике ДНК нагревают (денатурируют), чтобы разделить 2 нити. Далее добавляются праймеры и ДНК охлаждается, с тем чтобы опять образовались двойные нити. Затем в циклы добавляют ферменты, которые могут «прочитать» последовательность гена, что приводит к умножению ДНК. ПЦР используется для диагностики ген-специфических заболеваний, так же как и для выявления болезнетворных вирусов и/или бактерий, или в криминалистике в связи с подозрением в совершении преступления.

Вся информация носит ознакомительный характер. Если у вас возникли проблемы со здоровьем, то необходима консультация специалиста.

Читайте также

Вопросы и ответы

Что такое хромосомные нарушения и как они возникают?

В зависимости от хромосомного нарушения проявление симптомов может значительно отличаться и влиять на умственное и физическое здоровье. Многие хромосомные нарушения вызывают самопроизвольное прерывание беременности. Вам следует проконсультироваться у Вашего врача-генетика по поводу индивидуального риска хромосомных нарушений плода.

Для лучшего понимания сначала мы расскажем вам, что такое хромосомный набор.

Генетический материал во всех клетках организма человека организован в виде хромосом. Люди имеют 23 пары хромосом, в общей сложности 46 хромосом. Первые 22 пары нумеруются последовательно, и они известны как «аутосомы» . Последние две хромосомы определяют пол и известны как «гоносомы» или половые хромосомы (X и Y). У девочек две Х-хромосомы, а мальчики имеют одну X и одну Y-хромосому. Клетки размножаются путем деления. Перед каждым клеточным делением, хромосомы удваиваются и равномерно распределяются между двумя вновь созданными клетками.

Хромосомные нарушения — это изменения в хромосомах. Они возникают случайно из-за ошибок во время созревания яйцеклетки и сперматозоида (половых клеток) или — реже — из-за ошибок, при делении клеток во время развития оплодотворенной яйцеклетки. Численное хромосомное нарушение возникает, если клетка развивается с неправильным количеством хромосом. Например, хромосома может отсутствовать, то есть в клетке только 45 хромосом, или одна хромосома может быть лишней, то есть в клетке 47 вместо 46 хромосом.

НИПТ Panorama и НИПС определяет следующие хромосомные патологии: синдром Дауна, синдром Эдвардса, синдром Патау (лишние хромосомы в 21, 18 и 13-й паре)

В норме хромосомы составляют пару, но если их количество увеличивается на одну, эту патологию называют трисомией.

Наиболее часто встречающаяся трисомия — трисомия 21 хромосомы, которая вызывает хорошо известный синдром Дауна. Встречаемость: 1 на 500-800 новорожденных. Риск увеличивается с возрастом родителей.

Трисомия 18, известная как синдром Эдвардса, происходит гораздо реже. Частота рождаемости примерно 1 на 5000 новорожденных.

Трисомия 13 или синдром Патау, встречается еще реже, 1 на 7000 новорожденных.

Синдром Клайнфельтера (47, XXY)

Встречается у мальчиков с частотой 1 на 500 новорожденных.

Синдром Шерешевского-Тёрнера/ моносомия Х (Х0)

Если одна хромосома отсутствует, такую патологию называют моносомия. При моносомии X (Синдром Шерешевского—Тёрнера) вторая половая хромосома отсутствует. Встречается в среднем у 1 из 2500 новорожденных девочек.

Синдром трипло-Х (47, XXX)

Трисомия Х хромосомы встречается с частотой 1 на 1000 девочек. В большинстве случаев носители дополнительной X-хромосомы — женщины без заметных признаков патологии, поэтому при медицинских исследованиях 90% трисомиков по X-хромосоме остаются невыявленными.

Синдром XYY / Синдром Дипло Y / Синдром Якобса

Синдром XYY встречается только у мальчиков; присутствует дополнительная мужская хромосома. Частота заболевания — один на 1000 новорожденных мальчиков.

Плацентарный мозаицизм по хромосоме 7, выявленный по результатам полногеномного неинвазивного ДНК-скрининга анеуплоидий плода по крови матери

ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва

НИПС

НИПТ

ДНК-скрининг

скрининг

трисомия 7

анеуплоидия

мозаицизм

плацента

1. Brady P., Brison N., Van Den Bogaert K., de Ravel T., Peeters H., Van Esch H. et al. Clinical implementation of NIPT — technical and biological challenges. Clin. Genet. 2016; 89(5): 523-30.

2. Liang D., Lv W., Wang H., Xu L., Liu J., Li H. et al. Non-invasive prenatal testing of fetal whole chromosome aneuploidy by massively parallel sequencing. Prenat. Diagn. 2013; 33(5): 409-15.

3. Ma J., Cram D.S., Zhang J., Shang L., Yang H., Pan H. Birth of a child with trisomy 9 mosaicism syndrome associated with paternal isodisomy 9: case of a positive noninvasive prenatal test result unconfirmed by invasive prenatal diagnosis. Mol. Cytogenet. 2015; 8: 44.

4. Ekimov A.N., Ekimova E.V., Abubakirov A.N., Trofimov D.Yu. Results of the incorporation of the preimplantation genetic screening using Agilent platform into the clinical practice. 13-th Ann. Meet. Preimplantation Genet. Diagnosis Intern. Soc. (PGDIS). Canterbury, UK. Chromosome Research, December 2014, Vol. 22, Issue 4, Abstract book. pp. 573—643, P15.

5. Yang J., Qi Y., Guo F., Hou Y., Peng H., Wang D. et al. A case of placental trisomy 18 mosaicism causing a false negative NIPT result. Mol. Cytogenet. 2017; 10: 40.

6. Alberry M., Maddocks D., Jones M., Abdel Hadi M., Abdel-Fattah S., Avent N. et al. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast. Prenat. Diagn. 2007;27(5): 415-8.

7. Grati F. Chromosomal mosaicism in human feto-placental development: implications for prenatal diagnosis. J. Clin. Med. 2014; 3(3): 809-37.

8. Fryburg J.S., Dimaio M.S., Yang-Feng T.L., Mahoney M.J. Follow-up of pregnancies complicated by placental mosaicism diagnosed by chorionic villus sampling. Prenat. Diagn. 1993; 13(6): 481-94.

9. Wapner R.J., Simpson J.L., Golbus M.S., Zachary J.M., Ledbetter D.H., Desnick R.J. et al. Chorionic mosaicism: Association with fetal loss but not with adverse perinatal outcome. Prenat. Diagn. 1992; 12(5): 347-55.

10. Robinson W.P., Barrett I.J., Bernard L., Telenius A., Bernasconi F., Wilson R.D. et al. Meiotic origin of trisomy in confined placental mosaicism is correlated with presence of fetal uniparental disomy, high levels of trisomy in trophoblast, and increased risk of fetal intrauterine growth restriction. Am. J. Hum. Genet. 1997; 60(4): 917-27.

Поступила 27.03.2018

Принята в печать 20.04.2018

Для цитирования: Барков И.Ю., Шубина Е.С., Ступко О.К., Ким Л.В., Тетруашвили Н.К., Екимов А.Н., Ляпин В.М., Клименченко Н.И., Сокур Т.Н., Каретникова Н.А., Быстрицкий А.А., Муллабаева С.М., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Плацентарный мозаицизм по хромосоме 7, выявленный по результатам полногеномного неинвазивного ДНК-скрининга анеуплоидий плода по крови матери. Акушерство и гинекология. 2018; 10: 59-63.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.10.59-63

Положительный результат тестирования внеклеточной ДНК плода на трисомию 13 выявляет ограниченный плацентарный мозаицизм

Мы сообщаем о случае положительного результата теста cffDNA в сыворотке крови матери на трисомию 13. Диагностическое исследование показало мозаицизм трисомии 13 с помощью FISH и хромосомных анализов в культивируемой ткани сердечно-сосудистой системы, нормально хромосомы с помощью FISH и анализа кариотипа клеток околоплодных вод, а также нормальные хромосомы из постнатальной пуповинной крови. Мы пришли к выводу, что результаты cffDNA были связаны с мозаицизмом плаценты, но не плода, что указывает на ложноположительные результаты для кариотипа плода из-за CPM.

Мозаицизм определяется как наличие двух или более кариотипически различных популяций клеток. Мозаицизм для трисомии может возникнуть из-за постзиготического митотического нерасхождения в эмбрионе, который изначально был диплоидным, или постзиготного митотического восстановления трисомии в эмбрионе, который изначально был трисомен. ¹⁰ В зависимости от того, когда и в каком клоне клеток происходят эти события, при пренатальной диагностике мозаицизм может быть обнаружен в различных тканях. Мозаицизм может присутствовать только в плаценте (CPM), как в плаценте, так и у плода (истинный мозаицизм плода) или только у плода. ¹⁰ В случаях, связанных с плацентой, клетки цитотрофобласта, мезенхимные клетки ворсинок или оба типа клеток могут быть хромосомными аномальными или мозаичными. ¹⁰

В крупных многоцентровых исследованиях установлено, что частота мозаицизма при прямом или посевном анализе ткани сердечно-сосудистой системы составляет 1-2%. ^8,11 Когда в этих исследованиях с помощью CVS был обнаружен мозаицизм трисомии, в ~ 80% случаев хромосомные аномалии были ограничены плацентой с нормальной хромосомной конституцией плода.Кроме того, эти исследования показали, что если хромосомная аномалия была обнаружена прямым методом и, следовательно, ограничена тканью цитотрофобласта и не обнаружена в культивируемых ворсинах хориона, то хромосомная аномалия никогда не была подтверждена в тканях плода (например, амниоцентез, пуповинная кровь). . С другой стороны, хромосомные аномалии, обнаруженные в культивируемых ворсинах хориона, с большей вероятностью будут подтверждены у плода. Различия между тканями плода и цитотрофобласта встречаются чаще, чем различия между мезенхимальными тканями плода и ворсинок, вероятно, потому, что цитотрофобласты расходятся от линии эмбриональных клеток раньше, чем мезенхимальные клетки ворсинок.Учитывая, что тесты cffDNA оценивают фрагменты ДНК, предположительно происходящие из клеток цитотрофобластов, этот тест может приблизиться только к истинным показателям обнаружения анеуплоидии прямого CVS в отличие от анализа кариотипа культивированного CVS. Стоит отметить, что большинство цитогенетических лабораторий отказались от прямого анализа кариотипа CVS из-за повышенного уровня ложноположительных и ложноотрицательных результатов. ¹²

В настоящее время неизвестна частота ложноположительных результатов теста плода с анализом вкДНК материнской сыворотки из-за CPM или другого межплацентарного несоответствия плода.Ложноотрицательные результаты также могут возникнуть при тестировании cffDNA, если трисомический плод подвергается спасению трисомии только в плаценте. На плод оказывается более избирательное давление, поэтому это событие маловероятно; Однако есть редкие сообщения об этом событии. ¹³ Таким образом, важно, чтобы пациенты получали предварительное консультирование и давали информированное согласие до скрининга cffDNA. Пациенты должны быть осведомлены о возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а также неспецифических результатов из-за различий между плодом и анализируемым образцом, полученным из плаценты.Кроме того, также крайне важно, чтобы все пациентки с положительными результатами вкфДНК материнской сыворотки имели цитогенетическое подтверждение с помощью CVS и / или амниоцентеза перед принятием решения о прерывании беременности.

Трисомия 13 встречается с предполагаемой частотой от 1/8000 до 1/12000 живорожденных детей и 15/10 000 плодов в первом триместре. ¹⁴ Мозаицизм трисомии 13 встречается еще реже, учитывая, что ~ 5% живорожденных детей с трисомией 13 мозаичны. ¹⁵ Данные о результатах случаев пренатального диагноза мозаицизма трисомии 13 очень ограничены.В случаях мозаицизма, обнаруженного с помощью CVS, даже нормальный кариотип амниоцентеза не может исключить возможность истинного мозаицизма плода. ^15,16 Кроме того, в случаях, когда мозаицизм трисомии 13 подтверждается на основании амниоцентеза, результат может быть чрезвычайно вариабельным и может варьироваться от нормального до характерного фенотипа трисомии 13. ^17,18 Таким образом, возникают сложные и трудные консультационные ситуации, связанные с пренатальной диагностикой мозаичной трисомии 13. Важно сообщать о таких случаях в литературе, чтобы можно было собрать больше информации и сделать ее доступной для семейных пар в целях консультирования.

Диагноз мозаичной трисомии из CVS также может быть связан с наличием монородительской дисомии из-за спасения трисомии и иметь клиническое значение, если задействованная хромосома содержит импринтированные гены (хромосомы 7, 11, 14, 15 и 16). ¹⁹ Тестирование дородовой однопородной дисомии доступно и должно быть предложено в этих ситуациях. Кроме того, могут потребоваться дальнейшие исследования для определения оптимального ведения беременности с помощью CPM. Исследования показали, что беременность с CPM подвержена повышенному риску пренатальных и / или перинатальных осложнений, таких как ограничение внутриутробного развития.Следовательно, в этих ситуациях, вероятно, потребуется тщательный мониторинг этих беременностей. ²⁰

Ранее CPM выявляли только у женщин, перенесших CVS на ранних сроках беременности, и не выявлялись, если проводились только анализ сыворотки крови матери или амниоцентез. Учитывая, что тестирование cffDNA является неинвазивным методом тестирования с высокими показателями выявления, вполне вероятно, что в будущем это тестирование будет проходить больше беременных женщин и что будет обнаруживаться больше случаев CPM. Поэтому важно, чтобы медицинские работники лучше знали сложность этих ситуаций.

Как и в случае с любым новым тестом, возникают вопросы, связанные с тем, как этот тест должен быть интегрирован в клиническую практику. Тестирование cffDNA — это не простой анализ крови, и перед тестированием требуется информированное согласие. Лица, проходящие этот скрининг, должны понимать все возможные результаты. Что касается CVS, люди должны четко понимать возможность ложноположительного результата из-за CPM. Поскольку этот тест анализирует фрагменты ДНК, полученные из ткани плаценты, люди также должны понимать, что этот тест не является диагностическим и что все положительные результаты должны быть подтверждены с помощью CVS и / или амниоцентеза, особенно до любых дальнейших решений по ведению беременности.Объяснение этих сложных результатов и передача неопределенностей, связанных с тестированием, может быть трудным и может вызвать беспокойство у пациентов. В дальнейшем необходимо собрать больше данных о редких явлениях, таких как мозаицизм, чтобы пациенты могли лучше информироваться о влиянии патологических пренатальных тестов на их беременность.

Дискордантная циркулирующая ДНК плода и последующая цитогенетика выявляют ложноотрицательные генотипы вкДНК, мозаику плаценты и мозаику плода | Журнал трансляционной медицины

Резюме амниоцентеза, начиная с первого противоречащего результата НИПТ

Сто три (103) образца амниоцентеза (таблица 2) были кариотипированы нашей цитогенетической лабораторией детской больницы Акрона, начиная с первого образца, кариотип которого не соответствовал результат НИПТ (неинвазивное пренатальное тестирование НИПТ; циркулирующая фетальная ДНК вкДНК).Из этих плодов 53 были сонографически ненормальными (Таблица 2). Пятнадцать (15) из 97 были отклонены от нормы НИПТ, в том числе 9 подтверждены кариотипированием, в то время как оставшиеся 6 имели ложноположительные, противоречивые или мозаичные результаты, а один (1) с аномальным ультразвуком имел ложноотрицательный результат трисомии 18 по НИПТ (шесть выбранных случаи, перечисленные в таблице 1). Этот опыт включает ~ 60% подтвержденных аномальных результатов НИПТ плода. Эти подтвержденные результаты согласуются с положительным значением прогностического теста 40% для трисомии 18, полученным в очень большой тестируемой серии беременных пациенток (Bianchi et al.2014). Правильно идентифицированные хромосомные аномалии включают пять плодов с трисомией 18 и четыре плода с трисомией 21. Противоречивые результаты НИПТ включают трисомию 18, трисомию 21 или моносомию X (Таблица 1). Сообщений о рождении плода в результате экстракорпорального оплодотворения не поступало.

Результаты трисомии 18 плода

Пять результатов НИПТ, отражающие трисомию плода 18, были подтверждены последующими кариотипами амниоцитов.Напротив, один плод был зарегистрирован в раннем тесте как нормальный для всех хромосом, проверенных MaterniT21, включая хромосому 18 со специфичностью 99,6% и ДИ 99,2–99,6% для хромосомы 18 (таблица 1, случай 1). Специалист по материнской медицине плода проследил этот результат с помощью ультразвука, который обнаружил множественные аномалии, включая левостороннюю диафрагмальную грыжу с грыжей кишечника и печени, эхогенные почки и двусторонний гидронефроз. Когда амниоцентез был предложен и завершен на основании аномального ультразвукового исследования, кариотип плода с трисомией 18 был обнаружен во всех 28 из 28 исследованных амниоцитов (рис.1). Более половины наших пациентов из Огайо выбирают вынашивание плода с трисомией 18. В отделениях интенсивной терапии в 24 ближайших к нам больницах принят протокол, согласно которому комфортная помощь предоставляется только плодам с трисомией 18, пережившим роды, во избежание длительного пребывания в отделении интенсивной терапии. Учитывая эту информацию о протоколах интенсивной терапии, эта мать решила продолжить беременность, родила в своей местной больнице, а затем держала новорожденного в течение 40 минут, которые он выжил после рождения. Этот случай подчеркивает важность дальнейшего тестирования для оптимизации текущего ухода, если после нормального результата НИПТ наблюдается аномальное УЗИ плода.

Трисомия 18 амниоцитов плода, нормальных по данным НИПТ.

Другая пациентка, как сообщалось, вынашивала плод на 9 неделе и 3 дня беременности, «Положительный на трисомию 18» с чувствительностью 99,9% и доверительным интервалом 92,4–100% по MaterniT21 (таблица 1, случай 2). В этом отчете говорится: «Результаты ДНК-теста не обеспечивают окончательного генетического риска у всех людей… (и) не заменяют точность и точность пренатальной диагностики… (Этого пациента) следует направить на генетическое консультирование и предложить инвазивный пренатальный диагноз для подтверждения». результатов испытаний ».Акушер назначил повторение НИПТ на 23 неделе беременности, и этот результат был признан «нормальным для материала хромосом 21, 18 и 13» со специфичностью 99,6% и достоверностью 99,2–99,8% ». Директор лаборатории написал: «Повторное тестирование было отрицательным для трисомии 18, которая первоначально была отмечена как положительная… Проверка идентичности образца подтвердила, что исходный и повторно взятый образцы были от одного и того же человека. Подозревается биологическое вмешательство, но это несоответствие остается нерешенным ».Пациентка решила продолжить беременность и родила здоровых, нормальных мужчин . Были получены четыре биопсии из «зрелой плаценты с пятнистым легким ворсинчатым отеком и хорангиозом». При кариотипировании биопсий из 4 биопсий рассеченных ворсинок хориона, выращенных в двух культурах, было обнаружено 30 из 30 клеток с нормальным мужским кариотипом (рис. 2).

Нормальный доношенный кариотип плаценты у мужчин. Трисомия 18 по НИПТ.

Результаты трисомии 21 плода

Четыре (4) результата НИПТ, показывающие, что у каждого плода была трисомия 21, были подтверждены последующим кариотипом амниоцитов.Сообщалось, что пятый пациент вынашивал 16-недельный 5-дневный плод с положительной реакцией на трисомию 21 от Ariosa (таблица 1, случай 3). Последующий амниоцентез обнаружил 66 из 66 метафазных клеток с двумя нормальными копиями хромосомы 21 как с помощью FISH, так и с помощью кариотипирования. Фенотип новорожденного был нормальным (табл. 1, случай 3).

Другой пациент (таблица 1, случай 4), о котором сообщалось в данном документе, дал положительный результат на трисомию 21 по циркулирующей плацентарной ДНК, причем отчет о том, что вероятность того, что этот результат трисомии 21 будет правильным, был «подтвержден на 100%» [19; Ариоса Диагностика.Согласно руководящим принципам комитета ACOG, во всех случаях циркулирующей плацентарной ДНК (вкДНК), которые дали положительный результат на хромосомную аномалию плода, сообщается, что положительный результат был получен с помощью скринингового теста и что не следует принимать необратимого решения до завершения последующего амниоцентеза. . В соответствии с рекомендациями ACOG, Ariosa и Детского отделения медицины плода Ariosa и Akron во время консультации был предложен последующий амниоцентез. Мать решила завершить амниоцентез, который обнаружил 90% из 50 некультивируемых ядер интерфазных амниоцитов с нормальным паттерном хромосом 13 и 21 и без ядер с паттерном трисомии 21.Последующие кариотипы культивированных клеток обнаружили 28 из 28 амниоцитов с нормальными мужскими кариотипами 46, XY. Последующее ультразвуковое исследование уровня II показало, что у плода нет визуализированных фенотипических аномалий или мягких маркеров анеуплоидии. Пациентка решила продолжить беременность.

Поскольку плацентарный мозаицизм был ранее обнаружен в циркулирующей плацентарной ДНК [14] до родов, у этого плода была запрошена доношенная плацента вместе с образцом крови новорожденного. Этот плод G4P2 впоследствии был доставлен путем кесарева сечения на 38 неделе беременности с симметричным ограничением роста, но без фенотипа, связанного с трисомией 21.Запрошенная свежая плацента, хранившаяся в холоде в культуральной среде, была доставлена ​​в нашу цитогенетическую лабораторию для последующего анализа в соответствии с нашим стандартным протоколом POC (рис. 3, 4). Патолог произвел биопсию плаценты в четырех местах, и биопсированные ворсинки хориона были дополнительно препарированы до приблизительно 95% чистоты, переварены коллагеназой и культивированы. Кариотипы CVS из обеих двух успешно культивированных биопсий включали восемнадцать (18) клеток 47, XY, +21 и две (2) клетки 46, XY ^c .Эти результаты определяют происхождение аномальной трисомии 21 в результате циркулирующей ДНК плода и объясняют симметричное ограничение роста новорожденного.

Учитывая, что ~ 20% зарегистрированного плацентарного мозаицизма также обнаруживается у плода [14], у этого 6-дневного ребенка был запрошен образец крови новорожденного и кариотипирован в качестве второго образца ткани. Все 20 из 20 клеток были нормальными 46, XY мужского пола. Вместе с исходным кариотипом амниоцитов нормального мужчины 46, XY в 28 из 28 амниоцитов эти результаты подтверждают интерпретацию, что клетки 47, XY, +21 были ограничены плацентой ^c , что подчеркивает важность кариотипирования амниоцитов и пуповины новорожденного. лимфоциты периферической крови у фенотипически нормальных новорожденных.Вместе все эти результаты подтверждают интерпретацию, что аномальный кариотип трисомии 21 был ограничен плацентой, а плод имеет нормальный конституциональный кариотип (рис. 3). После этой саги о консультировании и тестировании эта пациентка выразила благодарность за тщательное консультирование и тестирование, которые она получала на протяжении всей беременности, подчеркнув важность поддерживающего ухода за пациентом.

a Периферическая кровь новорожденного с трисомией 21 по НИПТ. b Плацента новорожденного, по данным НИПТ, как трисомия 21.

Сообщалось, что мозаичная трисомия 21 / тетрасомия 21 / нормальный кариотип, ограниченный плацентой, была обнаружена в образце CVS в 1990-х годах, что могло быть связано с тетрасомией 21. Другие мозаичные хромосомные анеуплоидии, ограниченные плацентой, были зарегистрированы в 0,8 -> 2% жизнеспособных плодов. Взятые вместе, эти результаты согласуются с ранее описанным ограниченным плацентарным мозаицизмом, связанным с ЗВУР [13–15].Биопсия кариотипа плаценты также объясняет результаты теста вкДНК Ariosa, указывающие на генотип трисомии 21 плода, и дополнительно подчеркивает важность рекомендованного ACOG последующего кариотипа на амниоцитах [12] плюс кариотип крови новорожденного, чтобы определить, имеют ли обе эти ткани полностью нормальные хромосомы. . Стандартные лабораторные протоколы для анализа POC, согласно которым культура рассеченных ворсинок хориона, хранящихся при 4 ° C до 5 дней, обычно приводит к кариотипу плода в> 90% случаев, в то время как ворсинки плаценты, хранящиеся при комнатной температуре, также остаются жизнеспособными в течение 3 дней.Последующий FISH-анализ ядер залитых парафином, добавленных патологами, выявил общие анеуплоидии хромосом в большинстве оставшихся случаев, которые не могли расти в культуре [20, 21]. Наш лабораторный протокол, прилагаемый к этому отчету (рис. 3, 4), может быть легко принят в рекомендации Коллегии американских патологов (CAP).

Протокол дальнейшего тестирования плода после сообщения об аномальной плацентарной ДНК в кровотоке матери.

Результаты моносомии X

Случай 5 (таблица 1) — плод, который появился на сроке 27 недель 6 дней с задержкой внутриутробного развития плода.Учитывая поздний гестационный возраст плода, НИПТ был выбран в качестве наиболее подходящего теста, и образец материнской крови был отправлен в компанию Ariosa. 27,3% циркулирующей ДНК плода указали, что кариотип плода был моносомией X с вероятностью более 99/100 (99%). Больная вынашивала плод. При рождении плод был маленьким для гестационного возраста, с крестцовой ямкой, желтухой и плохим кормлением, которые разрешились, но в остальном фенотипически были нормальными. 6-дневный ребенок выписан домой. Тщательное медицинское обследование у генетика по 30 характеристикам через 2 месяца и снова через 3 месяца не выявило заметных отклонений.

Кариотипы и FISH анализ крови новорожденных обнаружил 45, X [9] / 46, X, dup (X) (q13q21.3) [41] (рис. 5) с одним локусом гена неактивного специфического транскрипта X (XIST) в полосе Xq13 от FISH. Анализ микроматрицы подтвердил наличие у новорожденного мозаичной клеточной линии 45, X в небольшой части клеток и второй более частой линии клеток с дупликацией на длинном плече X-хромосомы dup (X) (q21.1q21.33) в диапазоне от 83 317 750 до> 96 924 899 п.н. (рис.6). Эта дупликация привела к получению 3 полных копий области длинного плеча Х хромосомы с одной копией на нормальной Х-хромосоме и двумя копиями на Х с дупликацией.График Х-хромосомы микроматрицы (рис. 6) также показывает, что клетки с 45, X составляют от ~ 15 до> 20% от общего числа клеток в этом независимом образце. Эти мозаичные клетки 45, X объясняют результат моносомии X в части плацентарной ДНК, протестированной в материнской крови, которая соответствует IUGR на 27 неделе. FISH-анализ крови родителей показал нормальные образцы, указывающие на то, что хромосомные аномалии новорожденного являются de novo.

GTW-полосные кариотипы дупликации моносомии X и Xq у пациента 3.В третьем случае был мозаичный кариотип с моносомией X в 9 клетках и Х-хромосома с дупликацией длинного плеча 45, X [9] / 46, X, dup (X) (q13q22.1) [41]. Х-хромосомы с G-полосой в 9 клетках pf 50 показаны для линии клеток 45, X ( вверху, ) и 4 клеток второй линии клеток с дублированными участками хромосомы, указанными на нормальной идиограмме слева ( внизу ). Нормальная Х-хромосома проиллюстрирована для пяти метафазных клеток слева от Х-хромосомы с дупликацией длинного плеча справа от нее.Стрелки и обращены к полосам Xq21.1 и Xq21.2. [Иллюстрация любезно предоставлена ​​Джеймсом Мэлоуном, руководителем Детской цитогенетической лаборатории Акрона].

Х-хромосомы у пациента 3. Первичный результат сверху вниз — две копии Х-хромосомы в ~ 120 Мб X-хромосомы в ~ 85–90% клеток и одна копия Х-хромосомы в ~ 85–90% клеток. Х-хромосома [45, X] в ~ 18% клеток ( нижний треугольник ). Одна дополнительная копия участка Х-хромосомы [46, X, dup (X) (q21.1q21.3)] в ~ 82% клеток (верхний треугольник). FISH с дублированной областью подтвердил, что клетки с одной Х-хромосомой содержали только нормальную Х-хромосому, а каждая Х-хромосома имела единственный ген XIST в полосе Xq13. Горизонтальная ось , проведена, и результат нанесен на график в виде натурального логарифма данных, чтобы обеспечить количественное определение множества копий в одной и той же ячейке, которые иногда воспринимаются как усиленные копии. Изображение предоставлено Дэниелом Пинедой-Альваресом, доктором медицины, FACMG, заместителем директора по микрочипам, GeneDx.Разница в точках разрыва хромосомных полос GTW основана на анализе FISH с более низким разрешением с использованием ограниченного числа хромосомных зондов и измерении расстояния на идиограммах, которые не основаны на измеренном местоположении полосы.

Однородительская дисомия была также идентифицирована с помощью анализа полиморфных микрочипов в ДНК этого новорожденного от Xq21.33 до Xq28. Это, скорее всего, объясняется неравномерной рекомбинацией длинных плеч X в родительском мейозе I, которая приводит к дупликации с последующей косегрегацией нормальной и дублированной X-хроматид в одну и ту же гамету.Учитывая отсутствие четко определенных отцовских или материнских импринтированных участков генов на X-хромосоме, это открытие ниже дублированной области хромосомы на dup (X) (q21.1q21.3) не влияет на прогноз пациента. Учитывая единственный локус гена XIST как на нормальной, так и на производной Х-хромосоме пациента без дополнительной копии XIST с помощью FISH, это количество копий минимально изменяет фенотип новорожденного женского пола при условии, что контрольные точки дупликации не приводят к Х-сцепленному доминантному генетическому заболеванию. Это контрастирует с Х-хромосомой с двумя генами XIST, которые обычно инактивируют почти все гены Х-хромосомы, чтобы имитировать фенотип Тернера [22].Однако долгосрочный прогноз этой пациентки значительно изменяется, когда она достигает репродуктивного возраста с существенно повышенным риском хромосомно-аномальных гамет, происходящих из дублированной области хромосомы, что приводит к значительному увеличению риска выкидыша. Этот случай подчеркивает важность кариотипирования фенотипически нормального новорожденного после того, как он выявил аномалии с помощью НИПТ (рис. 7, 8).

Из случая плода 5. Слева DAPI окрашенные кариотипы нормальных хромосомных центромеров и хромосом с дупликацией Xq, помеченные как зеленый , и с центромеры 18 контрольной хромосомы, помеченные как aqua .

Случай 5. Кариотипы плода с DAPI-полосами нормальных и хромосомных центромер с дупликацией Xq [add (X)], помеченные как зеленый , и центромеры контрольной хромосомы 18, помеченные как aqua .

Трисомия 21 и сбалансированная реципрокная транслокация

Один из пяти пациентов с трисомией 21, протестированных НИПТ и подтвердивших наличие трисомии 21, также имел сбалансированную реципрокную транслокацию, характеризуемую кариотипом с G-полосой: 46, XY, t (5; 10) (p15 ; q12).(Таблица 1, случай 6; рис.9, 10). Был завершен контрольный микрочип, который подтвердил, что транслокация субмикроскопически сбалансирована, потому что субмикроскопическая делеция или дупликация в точке разрыва транслокации не могла быть обнаружена и не могла быть обнаружена одним микрочипом. . Этот конкретный случай подчеркивает, что после аномальных результатов НИПТ с помощью кариотипирования также обнаруживаются любые протестированные дополнительные хромосомные аномалии, которые в настоящее время не проверяются НИПТ.

Случай 6. Правые DAPI окрашенные интерфазные ядра с тремя центромерами 21 хромосомы, помеченными красным и зеленым , и двумя центромерами 21 хромосомы, помеченными контрольным датчиком центромеры 13 хромосомы, помеченным зеленым . Это подтверждает, что три копии критической области синдрома Дауна обнаружены в каждом ядре, и, следовательно, вышеуказанный кариотип приведет к синдрому Дауна. Левая Нормальная центромера Y хромосомы обозначена как красный , нормальная центромера Х хромосомы — как , зеленая и другая, поскольку нормальные центромеры 18 хромосомы, помеченные как aqua , отражают обычно изменяющуюся разницу в количестве центромерных повторов.

Ограниченный плацентарный мозаицизм мышечной дистрофии Дюшенна: клинический случай | Молекулярная цитогенетика

Фетоплацентарное расхождение с нормальным кариотипом в околоплодных водах и двумя разными клеточными линиями в плаценте

Мы представляем случай фетоплацентарного расхождения у плода во втором триместре с нормальным кариотипом в околоплодных водах и двумя различными Робертсоновскими транслокациями в плаценте. 41-летняя женщина ближневосточного происхождения, беременная 2, пара 1, перенесла амниоцентез на 16 неделе беременности из-за преклонного возраста матери.Кариотип околоплодных вод показал нормальный кариотип 46, XX с гомозиготным inv (9). Анализ родительских хромосом показал, что оба родителя являются носителями inv (9), а родители не являются кровными родственниками. УЗИ плода в норме. Через 4 недели мать обратилась в клинику с внутриутробной гибелью плода. Хромосомный анализ плаценты показал две разные клеточные линии: сбалансированную (15; 21) Робертсоновскую транслокацию в 11 клетках и несбалансированную (21; 21) Робертсоновскую транслокацию в 9 клетках.Кариотип интерпретировался как mos 45, XX, inv (9) (p11q13) x2, der (15; 21) (q10; q10) [11] / 46, XX, inv (9) (p11q13) x2, + 21, дер (21; 21) (q10; q10). Мать была носительницей муковисцидоза (дельта F508), лейденских мутаций фактора V, вариантов HbD-Los Angeles и HbQ-India. У нее также были родные братья и сестры, родившие мертворожденный срок. История ее мужа ничем не примечательна. Наш случай является еще одним примером ограниченного плацентарного мозаицизма (КПМ) с нормальным кариотипом плода. Однако мы не смогли подтвердить возможность того, что CPM способствовала IUFD в нашем случае, учитывая сложную историю болезни матери.

1. Введение

Внутриутробная смерть плода (IUFD) является серьезной проблемой в акушерстве. Общие показатели IUFD оцениваются примерно в 1% [1]. Успешный исход беременности во многом зависит от адекватного развития плаценты с низким сопротивлением фето-материнской циркуляции [2]. Аномальная плацентация во время беременности может быть связана с несколькими факторами, включая ограниченный плацентарный мозаицизм (CPM) и повышенную склонность матери к венозному тромбозу. Различия в кариотипе цитотрофобластов и клеток плода встречаются в 1-2% случаев [3].В большинстве из них хромосомные аномалии ограничены плацентой и могут быть связаны с плохим перинатальным исходом [4, 5]. Большинство таких хромосомных аномалий связаны с анеуплоидиями, а аутосомная трисомия, наиболее часто встречающаяся при структурном мозаицизме, встречается редко и часто бывает трудно интерпретируемой [6]. Феномен «ограниченного плацентарного мозаицизма (КПМ)» определяется как тканеспецифический мозаицизм, включающий цитогенетическую аномалию, ограниченную плацентой и отсутствующую у плода, возникающую из-за ранней митотической ошибки [7, 8].Были описаны три типа CPM. Во-первых, трисомный цитотрофобласт и диплоидная строма; во-вторых, диплоидный цитотрофобласт и трисомическая хорионическая строма; и в-третьих, трисомный цитотрофобласт и хорионическая строма. У всех трех типов мозаицизм ограничен плацентой и плод нормален [7]. Было показано, что задержка роста и смерть плода связаны с увеличением доли анеуплоидных клеток в плаценте и плацентарном клоне, даже когда хромосомная аномалия ограничивается исключительно плацентой, что свидетельствует о сильном влиянии плаценты на аномальное развитие плода [9– 11].Аномальная плацентация на ранних сроках беременности приводит к ограничению кровотока в плацентарно-плодном отделении. Повышенная предрасположенность матери к венозному тромбозу была связана с аномальной плацентацией [12]. Генетические факторы риска венозного тромбоза, такие как лейденский фактор V и мутация протромбина G20210A, были вовлечены в качестве причин аномальной плацентации [12, 13].

Здесь мы сообщаем о необычном случае фетоплацентарного несоответствия с точки зрения хромосомной аномалии и других генетических факторов риска матери, включая фактор V лейденского и варианты гемоглобина.

2. История болезни

37-летняя женщина ближневосточного происхождения, беременная 2, пара 1, перенесла амниоцентез на 16 неделе беременности из-за преклонного возраста матери. Мать имела обширный медицинский и семейный анамнез. Она гетерозиготна по мутации ΔF508, лейденской мутации фактора V, а также по вариантам гемоглобина D-Лос-Анджелес (HbD-Punjab) и гемоглобина Q-India (HbQ-India). Отцу было 36 лет, у него не было серьезной истории болезни, и он не является носителем лейденской мутации ΔF508 или фактора V.

Тестирование пренатальной анеуплоидии показало характер сигнала, соответствующий нормальным женским хромосомам, в то время как хромосомный анализ околоплодных вод подтвердил нормальный кариотип 46, XX. Интересно, что кариотип также показал гомозиготный inv (9) во всех проанализированных клетках (Рисунок 1). Ультразвуковое исследование плода было нормальным и не показало никаких необычных результатов. Хотя inv (9) считается полиморфным вариантом, из-за гомозиготной природы были предложены исследования родительских хромосом. Оба родителя показали inv (9) в своих соответствующих кариотипах, таким образом предполагая бипорительское наследование гомозиготного inv (9) у плода.